【摘要】 目的 研究临床分离的肠球菌对常用抗生素的耐药性及肠球菌与感染性疾病的关系。方法 应用纸片扩散法检测从临床标本中分离的311株肠球菌的耐药性；脉冲场凝胶电泳（PFGE）对细菌分型；病例回顾性分析。结果 肠球菌对临床常用的15种抗生素的耐药率以万古霉素最低；其次为氨苄西林/舒巴坦耐药率为17.4%；亚胺硫霉素耐药率为18.3%。粪肠球菌与屎肠球菌对抗生素的耐药率有明显差异。应用PFGE法将粪肠球菌分为A型及亚型、B型、C型及亚型、D型，屎肠球菌分为A、B、C型。结论 肠球菌对临床常用的15种抗生素的敏感性以万古霉素最敏感。肠球菌引起的不同系统感染，以泌尿系统最常见。PFGE对肠球菌感染流行监测是一个有力的工具。
【Abstract】 Objective To study Infections of Enterococcus spp and its resistance to antibiotics in 4 general hospitals.Methods Enterococcus resistance was tested using K-B methods. Organisms were indentified by API system and PFGE. The relationship between Enterococcus and infectious diseases was analysed according to clinical case.Results The resistant rate of Enterococcus against vanomycin was
【Key words】 Enterococcus Drug resistance, microbal Electrophoresis
肠球菌属是人体严重感染的病原菌之一，可引起人体多系统感染性疾病。对免疫力低下者可致严重感染，如心内膜炎、菌血症等。肠球菌感染的疾病逐年增加，在引起医院内感染因素中占第四位［1］。由于肠球菌对抗生素的耐药性增加，以及产β-内酰胺酶的肠球菌及耐高浓度氨基糖甙类抗生素肠球菌的出现，特别是近年出现的耐万古霉素的肠球菌给临床治疗造成困难，因此引起广泛重视。我们研究了肠球菌对常用抗生素的耐药性及肠球菌与感染性疾病的关系。
材料和方法
一、材料
1.菌株：(1)实验用临床菌株：实验所用菌株是1995年11月至1996年11月由北京医科大学第一医院、积水潭医院、北京医院、人民医院(分别以A、B、C、D表示)血、尿、痰、咽拭子、胆汁、宫腔分泌物、胸水、腹水、脑脊液等临床标本中分离311株肠球菌。(2)标准菌株：ATCC 25923（金黄色葡萄球菌）、ATCC 29212（粪肠球菌）购自卫生部临床检验中心。
2.抗生素纸片：氨苄西林、青霉素、头孢唑啉、丁胺卡那霉素、庆大霉素、氧氟沙星、环丙沙星、红霉素、氟哌酸、苯唑西林、利福平、哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦，购自中国药品生物制品检定所。亚胺硫霉素、万古霉素购自BBL公司。
3.主要试剂： API-20Strep 快速鉴定试剂盒：购自bioMeireux公司；MH培养基：购自中国生物制品检定所；Genepath Groupl Reagent Kit 购自Bid Rad 公司，批号310-0002 。
4.主要实验仪器：(1) 低温高速冷冻离心机HERMLE Z383K 德国BMH公司产品；(2) 多点接种仪I型，中国科学院计算机新电脑工程公司及北京医科大学联合生产；(3) CHEF-DRIII脉冲场凝胶电泳仪及配套设施，美国Bid-Rad产品。
二、方法
1.菌株鉴定：应用API-20 Strep鉴定系列，操作及结果判读按试剂盒说明完成。
2.抗生素敏感实验(纸片扩散法)：按美国临床实验室标准化委员会1995年版标准操作和判断结果。
3.染色体DNA脉冲场凝胶电泳(PFGE)：按试剂盒说明进行DNA包埋琼脂块的制备；电泳的选择程序为6Enc,
结果判断标准［2］：(1)酶切后图谱完全一致定为同一型如A型。(2)酶切后图谱与A型比较有1～3条带不同者，定为亚型(如A1.....An)。(3)酶切后图谱与A型比较如有3条以上带不同者则定为另一基因型如B、C、D型等。
4.统计学分析：列联表确切概率法，在SAS统计软件包上完成。
结果
1.四家综合医院肠球菌属分布情况：在311株肠球菌中，粪肠球菌占68.5%，屎肠球菌占21.9%，卡氏肠球菌5.1%，坚韧肠球菌占2.3％，鸟肠球菌占2.3%。
2.肠球菌属对抗生素耐药百分率：见附表。
附表 311株肠球菌对15种常用抗生素
的中介度及耐药率(%)
|
抗生素 |
粪肠球菌 (213) |
屎肠球菌 (68) |
三种肠球菌* (30) | |||
|
I |
R |
I |
R |
I |
R | |
|
青霉素 |
0.0 |
3.8 |
0.0 |
86.8 |
0.0 |
46.7 |
|
红霉素 |
17.0 |
72.7 |
2.8 |
89.9 |
16.7 |
70.0 |
|
庆大霉素 |
5.6 |
87.4 |
1.5 |
94.1 |
13.3 |
80.0 |
|
哌拉西林 |
22.1 |
2.8 |
10.3 |
76.5 |
23.3 |
50.0 |
|
丁胺卡那 霉素 |
0.5 |
94.8 |
0.0 |
98.5 |
0.0 |
96.7 |
|
氨苄西林 |
0.0 |
2.8 |
0.0 |
70.6 |
0.0 |
40.0 |
|
氟哌酸 |
0.0 |
80.3 |
0.0 |
92.6 |
0.0 |
80.0 |
|
氧氟沙星 |
29.1 |
52.1 |
1.5 |
91.1 |
10.0 |
73.3 |
|
利福平 |
13.1 |
79.4 |
1.5 |
89.7 |
13.3 |
73.4 |
|
头孢唑林 |
14.1 |
79.8 |
1.5 |
89.7 |
10.0 |
76.7 |
|
苯唑西林 |
0.0 |
100.0 |
0.0 |
100.0 |
0.0 |
100.0 |
|
万古霉素 |
18.7 |
0.0 |
5.8 |
0.0 |
6.7 |
0.0 |
|
环丙沙星 |
45.1 |
18.3 |
19.1 |
63.2 |
26.7 |
40.0 |
|
亚胺硫霉素 |
0.0 |
1.9 |
0.0 |
61.8 |
0.0 |
36.7 |
|
氨苄西林/ 舒巴坦 |
0.0 |
8.0 |
0.0 |
44.1 |
0.0 |
23.3 |
*包括卡氏肠球菌、坚韧肠球菌、鸟肠球菌；I：中介度，R：耐药
3.肠球菌引起感染性疾病的情况：通过对病历完整的110例住院患者分析，肠球菌引起的不同部位感染以泌尿系统感染最常见47例，占42.3% ，外科骨折术后感染次之17例，占15 .3%；肺部感染第三位10例，占9%。
4.PFGE法：结果见附图，12株粪肠球菌DNA经SmaⅠ酶切后PFGE电泳，分为A、B、C、D型及亚型，其中1号、2号菌株均为A6型，15号16号菌株为C1亚型，相互间具有同源性。其余菌株间无明显同源性。4株屎肠球菌DNA经SmaⅠ酶切后PFG电泳被分为A、B、C型，其中4号5号菌株均为A型，相互间具有同源性，其余无明显同源性。
粪肠球菌：1、2：A6型；3：D型；6：C2型；9：A1型；
10：A2型；11：A3型；12：A4型；13：A5型；14：B型；
15、16：C1型。屎肠球菌：4、5：A型；7：B型；8：C型
酶切后PFGE电泳Ⅰ M：Lambda ladders；
附图 肠球菌DNA SmaⅠ
讨论
1.肠球菌对常用抗生素耐药性分析：纸片扩散法药敏实验未筛选出耐万古霉素的肠球菌，对万古霉素中介度菌株占14.8% ，MIC法检测未发现耐药菌株。粪肠球菌对亚胺硫霉素耐药率仅为1.9％，其次是氨苄西林。
本次试验结果表明屎肠球菌耐药性高于粪肠球菌，特别是对β-内酰胺类抗生素的耐药性高。Goudron等［3］实验证明粪肠球菌和屎肠球菌的药物敏感性明显不同，表现为屎肠球菌对β-内酰胺类抗生素及氨基糖甙类抗生素的耐药性高。其耐药机理是因屎肠球菌能产生6′-乙酰转移酶，该酶对抗卡那霉素、妥布霉素、乙基西梭霉素［4］。由于肠球菌属中各种菌对抗生素的耐药性有差异，因此临床细菌鉴定肠球菌属应到种的水平，以便指导临床合理选用抗生素。
本实验未发现耐万古霉素的肠球菌，仅有少数肠球菌处于中介度。耐万古霉素的肠球菌在国外报道较多，可能由于万古霉素及Teicoplanin、头孢他啶在欧洲广泛应用而引起耐药菌株的出现［5］，国家医院感染监测系统报告，肠球菌对万古霉素的耐药率从1989年的0.3%增加到1993年的7.9%，在美国已从1989年的0.8%增加到1993年的13.3%［6］，而国内万古霉素耐药菌较少，这可能与万古霉素的使用较少有关，值得警惕的是本次实验发现国内肠球菌对万古霉素存在中介度菌株14.8%，这一潜在因素可能将导致耐万古霉素的肠球菌的出现。所以要密切关注耐万古霉素的肠球菌的流行和播散。
2.肠球菌引起的不同部位的感染 ：本试验结果研究表明肠球菌可以引起不同部位的感染，以泌尿系感染率最高(42.3%)，外科手术伤口感染及下呼吸道次之，分别为15.3%和9%。这三部位的感染占整个感染的66.7%。提示在医院感染管理中应加强上述部位感染的控制和预防，才能达到有效降低医院感染的目的。
本试验结果与Hirose报道的外科伤口感染占第一位(15%)、泌尿系感染第二位(13%)、败血症第三位(9%)的结果略有差异。
3.肠球菌PFGE法初步分型：为了进一步对肠球菌引起的感染进行病原学研究，我们选了同一病房留标本时间在20天内的16株引起感染疾病的肠球菌(粪肠球菌12株，屎肠球菌4株)，根据耐药谱不同分为3组：(1)对头孢唑林、丁胺卡那霉素、头孢哌酮耐药，对万古霉素敏感的共12株；(2)对氨苄西林、青霉素、亚胺硫霉素、哌拉西林、头孢唑林、丁胺卡那霉素、头孢哌酮耐药，对万古霉素敏感的3株；(3)对上述抗生素完全敏感的1株，应用PFGE法进行分析：12株粪肠球菌(根据病历资料其中2株为院内感染菌)分成4型及亚型(A1、A2、A3、A4、A5、A6、B、C1、C2、D)。屎肠球菌4株分成3型(A、B、C)。
4.临床病例分析：通过PFGE法进行流行病学分析：1995年12月中、下旬A院内七病房发生了A6型粪肠球菌引起院内感染散发流行，2例患者其中一例年龄为76岁，患急性心肌梗塞；另一例80岁，患帕金森病，由该菌引起肺部感染，曾用环丙沙星、亚胺培南、氨苄西林/舒巴坦抗炎治疗，但终因全身衰竭死亡。
9月底妇产科病房发生了C1型粪肠球菌的散发流行，该菌导致一例产妇宫腔感染，另一例慢性盆腔炎患者泌尿系感染，两者用灭滴灵、氟哌酸、呋喃坦丁、青霉素治疗好转。
B院1996年6月中旬，内科病房发生了屎肠球菌A型感染的散发流行，该菌导致一个患者发生泌尿系感染，用亚胺硫霉素、氨苄西林/舒巴坦治愈；另一例患者肺部感染，用氨苄西林、头孢哌酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸治疗好转。
总之，肠球菌属因其固有的和获得性的多重耐药性，是目前临床遇到的棘手问题，对其耐药机制的研究能更好地指导临床使用抗生素有效地控制其感染。PFGE法对感染性疾病病原菌的流行病监测是一个有力的工具。
参考文献
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