【摘要】　目的　了解酵母菌对氟康唑的敏感性，并对3种抗真菌药敏试验方法进行比较。方法　利用纸片扩散法，微量稀释法及浓度梯度法(Etest法)测定92株临床分离酵母菌对氟康唑的敏感性。结果　Etest法和微量稀释法所测酵母菌对氟康唑的总敏感率分别是73.9%和81.5%。纸片扩散法所测敏感菌，微量稀释法全部敏感，Etest法敏感率为91%；纸片扩散法所测耐药菌，其余两种方法检测多数仍为敏感。从不同菌种来看，白念珠菌、热带念珠菌、假热带念珠菌、葡萄牙念珠菌、白吉利丝孢酵母菌及酿酒酵母菌对氟康唑全部敏感；氟康唑对克柔念珠菌及光滑念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)值均较高；近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、异常汉逊酵母菌及新型隐球菌中的部分菌株对氟康唑敏感，部分菌株为剂量依赖性敏感，未发现耐药菌株。结论　氟康唑对除克柔念珠菌及光滑念珠菌的MIC值较高外，其余酵母菌对氟康唑敏感性好。纸片扩散法虽简便，但仅可用于初筛敏感菌，对抑菌环直径≤14 mm者应进一步用微量稀释法或Etest法测定其MIC值。

　　Comparison of three methods for fluconazole antifungal susceptibility test　Shen Dingxia, Xie Ling, Liu Mei, et al. Department of Microbiology, General Hospital of PLA, Beijing 100853

　　【Abstract】　Objectives　To study the susceptibility of yeasts to fluconazole and to compare three methods for antifungal susceptibility test.Methods　92 clinical isolates of yeasts were examined for the susceptibility to fluconazole by disk diffusion test, broth microdilution method and E test.Results　The total susceptibility rate of yeasts to fluconazole was 73.9% and 81.5% by E test and broth microdilution method respectively. Susceptible strains by disk diffusion test were all susceptible by broth microdilution method recommended by NCCLS and 91% susceptible by the E test. Those with inhibition zone diameters of ≤14mm were almost susceptible by another 2 methods. As concerned with the species, C.albicans, C.tropicalis, C.pseudotropicalis, C.lusitaniae, Trichosporon beigelii and Saccaromyces cerevisiae were all susceptible to fluconazole, their MICs≤8 μg/ml; C.krusei and Torulopsis glabrata possessed higher MICs of all≥16 μg/ml, even≥256 μg/ml. Some of Hansenula anomala, C.guilliermondii, C.parapsilosis and Cryptococcus neoformans were susceptible, and some were dose-dependent susceptible to fluconazole.Conclusions　Almost all yeasts examined are susceptible to fluconazole except C.krusei and Torulopsis glabrata. The disk diffusion test can only be used to screen sensitive strains although it is easier to be done, the MICs must be tested by broth microdilution method or E test when the inhibition zone is≤14mm.

　　【Key words】　Yeasts　　Fluconazole　　Microbial sensitivity tests

　　近年来，由于激素、免疫抑制剂及广谱抗生素的广泛应用，器官移植术的普遍开展，以及艾滋病病人的不断增加，原发及继发性免疫功能低下人群扩大，全身性真菌感染日益增多，抗真菌药物的使用，又使真菌的耐药现象出现^［1］。因此，开展真菌的体外药敏试验，指导临床医生合理用药已受到越来越多的关注。

　　我们应用纸片扩散法、微量稀释法及浓度梯度法(Etest法)分别测定并比较了92株分离自临床标本的酵母菌对氟康唑(临床应用最多的抗真菌药物之一)的敏感性，现报告如下。

材料与方法

　　一、 材料

　　1.试验菌：92株酵母菌分别来自临床送检的血液、脑脊液、腹膜透析液、痰和尿等标本。按常规方法和API 20C AUX，或用YBC卡经 VITEK仪器鉴定，其中包括白色念珠菌21株、热带念株菌13株、近平滑念珠菌9株、克柔念珠菌4株、季也蒙念珠菌8株、假热带念珠菌8株、葡萄牙念珠菌2株、新型隐球菌6株、光滑念珠菌12株、白吉利丝孢酵母菌3株、异常汉逊酵母菌4株及酿酒酵母菌2株。

　　2. 标准质控菌：采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的质控菌，近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258，由美国德克萨斯医学院病理室Wanger先生惠赠。

　　3. 抗真菌药：氟康唑标准品由中国大连辉瑞制药有限公司提供，批号为4L334-92QCS-6,将其配制成1 280 μg/ml的水溶液，分装后存于-60℃冰箱内，用于纸片扩散试验及微量稀释试验。氟康唑纸片每片含氟康唑25 μg（空白纸片由北京天坛药品生物制品检定所抗生素研究室提供）。微量稀释法所用氟康唑最大浓度为128 μg/ml，并经用生理盐水倍比稀释至0.125 μg/ml，共11个浓度。氟康唑Etest法试条为瑞士AB Biodisc 公司产品，药物浓度范围为0.016～256 μg/ml。

　　4. 培养基：RPMI 1640(含谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)，用吗啉代丙烷磺酸(MOPS)缓冲液调pH值为 7.0 ，过滤除菌后用于微量稀释法中的菌液稀释。在此RPMI 1640液中加入2%葡萄糖及1.5%琼脂，倾倒平板，用于纸片扩散试验。Etest法采用含酪蛋白胨的培养基，按商家提供的方法配制。

　　二、方法

　　1. 菌液制备：将受试菌在沙保弱平板上转种两次以保证其纯度及生长力，用0.85%的盐水制成菌悬液，并调整其浊度，除新型隐球菌浊度为1个麦氏单位，其余酵母菌浊度为0.5麦氏单位，此菌悬液可用于纸片扩散试验及Etest法。将以上浊度的菌悬液于血细胞计数板上计数为1×10⁶～5×10⁶菌落形成单位(CFU)/ml，经RPMI1640液体培养基稀释1 000倍至最终浓度为1×10³～5×10³ CFU/ml，用于微量稀释法药敏试验。

　　2. 纸片扩散法和Etest法：用棉棒将所制菌液均匀涂布至RPMI 1640和酪蛋白胨培养基平板上，待平板表面干后分别贴氟康唑纸片和Etest试条，放35℃培养。

　　3. 微量稀释法：按照 1995年NCCLS推荐的酵母菌微量稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案^［2］进行，简述如下：取经无菌处理的96孔U形板自第1～11孔，分别加入100 μl已稀释的不同浓度氟康唑药液及100 μl已制备的菌悬液，第12孔作为生长对照孔，只加菌液而不加药液，置35℃孵育。

　　以上3种试验同时进行，并平行检测两株标准质控菌对氟康唑的敏感性。

　　4. 结果判定：新型隐球菌培养48小时，其他受试菌于培养24小时读取结果。纸片扩散法结果记录抑菌环直径(mm)；微量稀释法和Etest法终点记录最低抑菌浓度或80％抑菌浓度（μg/ml)。

结果

　　1.纸片扩散法、微量稀释法及Etest法：表1为纸片扩散法与其他两种方法结果的比较，抑菌环直径≥19 mm判为敏感，≤14 mm判为耐药，15～18 mm判为剂量依赖性敏感(S-DD)。两株质控菌的抑菌环直径均≤14 mm。

表1　纸片扩散法真菌药敏试验与微量稀释法及E test法的比较

　　2.微量稀释法和Etest法：两种方法所测质控菌的最小抑菌浓度(MIC)均为：克柔念珠菌ATCC 6258 32 μg/ml，近平滑念珠菌ATCC 22019 4 μg/ml；检测试验菌的结果及其比较如表2。

讨论

　　多年来，研究者们致力于抗真菌药物敏感试验方法的研究并取得了一定成绩^［3～5］。我们根据文献［6］报道，选用25 μg氟康唑纸片来测定酵母菌对此药的敏感性，结果是纸片扩散法敏感的菌株，微量稀释法也全部敏感；但纸片扩散法耐药菌中,用另外两种方法多数仍为敏感(特别是白念珠菌)，部分呈S-DD和耐药。因此，我们认为纸片扩散法仅可作为初

表2　微量稀释法与Etest法真菌药敏试验结果的比较(株数)

　　注：S：MIC≤8 μg/ml；S-DD：MIC 16～32 μg/ml；R：MIC≥64 μg/ml筛试验，对敏感菌作初步报告，如遇抑菌环直径≤14 mm时, 应进一步测定其MIC值。

　　Etest法是一种新型的检测细菌或真菌对抗菌药物敏感性的方法，主要包括一含有连续抗菌剂梯度的试条，文献报道该法与微量稀释法具有良好的一致性^［5］。我们的结果也说明两者的符合率高，只是Etest法所测MIC值普遍略高于微量稀释法，此与Colombo等^［5］在进行白念珠菌药敏试验时报告的结果一致，可能与Etest法所采用的连续抗菌剂梯度，以及椭圆抑菌环内有微小菌落存在导致终点判读误差所致。

　　目前NCCLS尚未确定抗真菌药物敏感试验结果的判读界限，对纸片扩散法结果的判读，我们采用Barry等^［6］的界限。最近根据药敏试验结果与临床治疗效果关系的观察，Rex等^［7］提出，氟康唑对酵母菌的MIC≥64 μg/ml为耐药；MIC在16～32 μg/ml为剂量依赖性敏感；MIC≤8 μg/ml为敏感。我们采用此标准，多数菌种对氟康唑敏感，氟康唑仅对克柔念珠菌及光滑念珠菌的MIC值较高。因此，对此两种菌感染治疗如选用氟康唑，应掌握好剂量，并注意观察疗效或改换其他抗真菌药。

参考文献

　　1Ghannoum MA, Rex JH, Galgiani JN. Susceptibility testing of fungi: current status of correlation of in vitro data with clinical outcome. J Clin Microbiol, 1996, 34: 489-495.

　　2National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Tentative standards. Document M27-T. Wayne Pennsylvania: NCCLS, 1995. 15: 1-22.

　　3周贵民, 谢灵. 酵母菌的药敏测定方法学探讨. 中华医学检验杂志, 1991,14:160-163.

　　4Dannaoui E, Colin S, Pichot J, et al. evalsuation of the E test for fluconazole susceptibility testing of Candida albicans isolated from oropharyngeal candidiasis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1997, 16:228-232.

　　5Colombo AL, Barchiesi F, McGough DA, et al. Comparison of E-test and national committee for clinical laboratory standards broth macro dilution method for azole antifungal susceptibility testing. J Clin Microbiol, 1995, 33: 535-540.

　　6Barry AL, Brown SD. Fluconazole disk diffusion procedure for determining susceptibility of Candida species. J Clin Microbiol, 1996, 34: 2154-2157.

　　7Rex Jh, Pfaller MA, Galgiani JN, et al. Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibililty test: conceptual frame work and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, Itraconazole and candida infections. CID, 1997, 24: 235-247.

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