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    微量法检测曲霉对六种抗真菌药物的敏感性



    录入时间:2010-11-24 13:11:41 来源:维普

     

    1997年美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)公布了M27-A方案,即酵母菌的液体培养基稀释法抗真菌药物敏感试验标准方案,表明酵母菌的体外药敏试验已趋于标准化,而丝状真菌药敏试验还在不断发展。我们以此方案中的微量法为基础,探讨并建立曲霉的标准化药敏试验方法。

      一、材料和方法

      1.试验菌株来源:受试菌株31株:烟曲霉14株、黄曲霉8株、黑曲霉5株、构巢曲霉3株和土曲霉2株。试验菌株由临床株和环境株组成,主要由北京医科大学第一医院、中国科学院微生物研究所等提供。

      2.抗真菌药物包括:5-氟胞嘧啶(5-FC) 和两性霉素BAmB)由Sigma公司提供,氟康唑(FCZ)由三维制药公司提供,酮康唑(KCZ)和伊曲康唑(ICZ)由杨森制药公司提供,特比萘芬(TBF)由诺华制药公司提供,贮存液的制备详见参考文献[1]。

      3.培养基:RPMI-1640液体培养基,唯有TBF试验用2%沙氏液体培养基(SDB)。

      4.方法:参照NCCLS方案(1997年版)2进行,但有如下几点说明。(1)TBF药液制备:TBF贮存液用SDB稀释,终浓度0.031316 μg/ml。(2)菌悬液制备:将受试菌株在麦芽培养基30℃生长710天,菌悬液经振荡和培养基稀释,其终浓度至0.5×1042.5×104CFU/ml。(3)结果判定:经30℃培养4650小时后观察结果。本试验结果AmB0:肉眼清晰为判定终点,其余5种药物取:略模糊(80%受抑制)或:浊度显著减低(50%受抑制)为判定终点2,3。

      三、结果

      1、6种抗真菌药物对31株曲霉的MIC值的几何均数及MIC值范围见表1。ICZTBF31株曲霉的MIC值的几何均数较低,ICZ仅对3株曲霉的MIC≥1 μg/ml,其中对2株的MIC值为1 μg/ml,对1株的MIC值为2 μg/ml;TBF4株曲霉菌的MIC≥1 μg/ml,其中3MIC值为1 μg/ml,对1MIC值为2 μg/ml;AmBMIC值集中在1 μg/ml2 μg/ml,其中AmB15株的MIC值>1 μg/ml,其中MIC值为2 μg/ml、4 μg/ml8 μg/ml者分别为10株、3株和2株;KCZ20株曲霉菌的MIC值>1 μg/ml;FCZ12株曲霉菌的MIC≥64 μg/ml;5-FC20株曲霉菌的MIC≥32 μg/ml,其中11株的MIC值为32 μg/ml,9株的MIC≥64 μg/ml。

      2.6种药物对曲霉菌的MIC值进行秩和检验,结果表明,ICZTBF对曲霉菌的MIC值均值明显低于其他4种药物(P0.01)。

    1 6种抗真菌药物对5种曲霉菌的MIC值几何均数及范围(μg/ml)

    抗真菌药

    烟曲霉14

    黄曲霉8

    黑曲霉4

    构巢霉3

    土曲霉2

    均值

    MIC范围

    5-FC

    27.57

    26.89

    22.62

    31.98

    32.00

    27.35

    464

    FCZ

    37.11

    29.33

    22.62

    31.28

    24.00

    31.28

    464

    KCZ

    2.21

    1.54

    2.38

    2.00

    0.75

    1.34

    0.2516

    ICZ

    0.24

    0.35

    0.21

    0.20

    0.19

    0.30

    0.032

    AmB

    1.41

    1.83

    0.19

    1.02

    0.75

    1.17

    0.258

    TBF

    0.37

    0.27

    0.42

    0.13

    0.31

    0.31

    0.062

      注:5-FC:5-氟胞嘧啶;FCZ:氟康唑;KCZ:酮康唑;ICZ:伊曲康唑;AmB:两性霉素B;TBF:特比萘芬四、讨论

      目前丝状真菌药敏试验的理想条件是:(1)接种浓度104CFU/ml;(2)孵育时间4872小时;(3)终点判读宜通过比色法,得到更为精确的MIC3,4。

      在试验中,ICZ、TBFMIC值较低,显示曲霉菌对这两种药物高度敏感,其中MIC≥1 μg/ml的菌株,ICZ仅有3株,TBF仅有4株。资料表明5,临床治疗中发现的ICZ耐药菌株,其MIC≥16 μg/ml,而本试验ICZMIC值全部小于16 μg/ml,说明目前国内曲霉菌株仍对ICZ高度敏感,尚未发现耐药株;资料6表明,TBF对曲霉有较强的抑菌作用,其均值MIC50/MFC900.41.6 μg/ml,其耐药标准与AmB相当,在与AmB、KCZ、5-FC相比的曲霉药敏试验中,其敏感性明显高于这些药物,表明TBF有可能用于曲霉病的治疗。AmBKCZMIC值较高,其中MIC值>1 μg/ml的菌株分别为15株和20株;对于5-FCFCZ,依据M27-A方案念珠菌的耐药标准,5-FCMIC≥32 μg/ml的菌株有20株,FCZMIC≥64 μg/ml的菌株有12株,表明后4种药物对曲霉的敏感性较差。值得说明的是,31株曲霉菌中AmBMIC值>1 μg/ml15株,而临床工作中,AmB治疗曲霉病有较好的疗效5,这一点可能恰好反映出M27-A方案本身对AmB的耐药性检测不敏感的问题。

      志谢 本课题得到北京医科大学第一临床医院诺华真菌研究中心的资助

      参考文献

      [1] 王文莉,王端礼,李若瑜,等.酵母菌的NCCLS药敏试验方法及其应用.中华医学检验杂志,1997,20:119-122.

      [2] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard M27-A. Pennsylvania:NCCLS, 1997.1-21.

      [3] Espinel-Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evalsuation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. J Clin Microbiol,1997,35:139-143.

      [4] 刘伟,李若瑜,王端礼.丝状真菌药敏试验的研究进展.中华医学检验杂志,1997,20:313-315.

      [5] Denning DW,Venkateswarlu K, Oakley KL,et al. Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Chemother,1997,41:1364-1368.

      [6] Ryder SN, Favre B. Antifungal activity and mechanism of action of Terbifine. Rev.Contemp.Pharmacother,1997,8: 275-287

     

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