【摘要】目的检测与分析细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因，探讨细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因基础。方法分别分离16株自发形成和用利福平、异烟肼、乙胺丁醇诱导形成的结核分枝杆菌的染色体DNA，PCR扩增IS986序列以及rpoB、katG和embB基因后进行凝胶电泳和序列分析。结果自发形成及抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型可在含利福平、异烟肼、乙胺丁醇的培养基内生长与传代培养。基因检测与分析显示，结核分枝杆菌稳定L型仍然保留IS986基因，rpoB、katG、embB基因也未见突变。结论结核分枝杆菌稳定L型可自发形成，也可被利福平、异烟肼和乙胺丁醇诱导形成。结核分枝杆菌稳定L型对利福平、异烟肼、乙胺丁醇形成耐药性，但其染色体上耐药相关基因并没有发生突变。除染色体耐药相关基因突变可造成结核分枝杆菌形成耐药性外，细胞壁缺陷也是造成结核分枝杆菌形成耐药性的一个重要机制。
【关键词】 结核分枝杆菌；细胞壁；基因；耐药性
ABSTRACT Objective To determine and analyze the genes related to drug resistance， and probe the properties of drug resistance genes of Mycobacterium tuberculosis. Methods The sequence of IS986 and the genes of rpoB， katG and embB were isolated respectively from the L-forms derived spontaneously and induced by rifampin， isoniazid and ethambutol respectively from 16 strains of M.tuberculosis， and then the genes were determined by agarose gel electrophoresis and analyzed by direct sequencing. Results The both of L-forms derived spontaneously and induced from M.tuberculosis were grow well and be subcultured in the non-high osmotic liquid media with rifampin ， isoniazidand ethambutolrespectively. The sequence of IS986 and the genes of rpoB， katG and embB were held in the stable L-forms and no gene mutation was found in them. Conclusion The L-forms were formed spontaneously or induced by rifampin， isoniazid and ethambutol. The L-forms derived either spontaneously or induced by the antibacterial drugs from drug susceptible strains of M.tuberculosis revealed the resistance to rifampin， isoniazid and ethambutol but no gene mutation of rpoB， katG and embB could be found in the variants. It was considered that the cell wall deficiency was an important resistant mechanism of M.tuberculosis besides the chromosomal gene mutation.
KEY WORDS Mycobacterium tuberculosis; Cell wall; Gene; Drug resistance
细胞壁缺陷是结核分枝杆菌最常发生的变异现象之一，被认为是结核分枝杆菌生命周期独特的一个形态时期或相［1］。然而近年的研究［2］发现，结核分枝杆菌不仅可在人工培养基及动物体内自然发生细胞壁缺陷变异，而且也可在利福平、异烟肼和乙胺丁醇等抗结核药物的诱导下发生细胞壁缺陷变异以及在含高浓度抗结核药物的培养基内传代培养。文献［3］报道，结核分枝杆菌耐药性的形成主要同其染色体上耐药性相关基因突变有关，尚未发现质粒等其他细菌所具有的耐药性机制。为探讨细胞壁缺陷导致结核分枝杆菌形成耐药性的基因机制，本文采用基因检测与分析的方法，对自发形成和抗结核药物诱导形成的细胞壁缺陷结核分枝杆菌的耐药性相关基因进行了检测与分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株 16株结核分枝杆菌分别为质控菌1株，中国药品生物制品检定所提供，本室编号Mk；临床分离菌15株，获自贵阳市肺科医院住院肺结核患者痰标本，本室编号M1～M15。
培养基 苏通培养基，按文献［4］方法制备。
诱导剂 利福平胶囊，批号：国药准字H21021905，沈阳红旗制药有限公司提供；异烟肼片成都锦华药业有限公司提供，批号H51020788；乙胺丁醇片批号010101，成都锦华药业有限公司提供。
结核分枝杆菌基因检测试剂盒 扩增结核分枝杆菌染色体DNA重复保守序列IS986，引物碱基序列为5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3，5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3，扩增产物分子量为245bp。华美生物工程公司提供，批号20050501。
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
rpoB基因检测试剂盒 扩增序列涵盖rpoB基因的第507至533位密码子，rpoB基因外套引物碱基序列为rpoB P1：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P2：5-AGTGCGACGGGTGCACGT-CGCGGACCT-3，扩增片段215bp；内套引物碱基序列为rpoB P3：5-CGTGGAGGCGATCACACCGCA-GACGTT-3，P4：5-GACCTCCAGCCCGGCACG-CTCACCT-3，扩增片段193bp，无锡市克隆遗传技术研究所提供，批号050613。
katG基因检测试剂盒 上游引物5-AGCTCGTATGGCACCGGAAC-3，下游引物5-TTGACCTCCCACCCGACTTG-3，扩增katG基因904、1523bp，扩增片段为katG基因突变热点区，包括315、321、381、406、409、418、441、456、463和476位，无锡市遗传克隆技术研究所提供，批号050613。
embB基因检测试剂盒 embB基因外套引物的碱基序列为E15-CGGCCTGCATCGTCGCCGGG-3、E2 5-GATCCACAGACTGGCGTCGCTG-3，内套引物E3 5-CGGCATGCGCCGGCTGATTCC-3、E4 5-TCATCAGCGCCAGCAGGTTGTAA-3；E1、E2引物扩增embB基因自7721～8002共282bp碱基序列，E3、E4引物扩增embB自7741～7973共233bp碱基序列，第二次扩增的片段包括embB的突变热点区，即第285位、306位、和330位共77个密码子，扩增产物分子量为233bp，无锡市遗传克隆研究所提供，批号分别为021211、031013、030610、040503。
PCR产物纯化试剂盒 Ultra Clean PCR Clean-up Kit，美国MOBIO公司提供。
PCR测序试剂 BigDye Terminator Kit，美国PE公司提供。
1.2 方法
菌种鉴定 用BACTEC-TB460检测系统以及结核分枝杆菌基因检测试剂盒推荐的方法，对各菌株分别进行菌种鉴定，染色体IS986序列PCR扩增与检测，RFP、INH和EMB敏感性测定以及rpoB、katG和embB基因的PCR扩增与序列分析。
稳定L型诱导与分离 根据各菌株的药物敏感性及其耐药相关基因检测结果，选择rpoB基因未发生突变的Mk、M4、M5菌株和突变的M13菌株，katG基因未发生突变的M15菌株和突变的M5、M8菌株以及embB基因未发生突变的M2、M4、M5、M6、M7、M8菌株。按文献［2］方法将各菌株分别接种于不含药物的苏通培养基，将rpoB未突变菌株接种于含RFP 0.1、0.2、0
稳定L型鉴定 按上述菌种鉴定的方法，分别提取各菌株自发形成和诱导形成的L型的染色体DNA，进行IS986序列PCR扩增与检测。
稳定L型药物敏感性检测 取自发形成及RFP、INH、EMB诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型纯培养物，分别接种于含不同浓度RFP、INH及EMB的苏通培养基内，置普通温箱内
稳定L型耐药性相关基因检测 根据结核分枝杆菌rpoB、katG、embB基因检测试剂盒推荐程序，分别提取自发形成及RFP、INH、EMB诱导形成的稳定L型染色体DNA进行PCR扩增和2%琼脂糖凝胶电泳及紫外检测仪观察。rpoB、katG、embB基因的PCR扩增产物分别纯化后，在自动测序仪上进行序列测定与分析。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌的药物敏感性
Mk、M4、M5对RFP敏感，M13对RFP耐药；M5、M15对INH敏感，M8对INH耐药；M2、M4、M5、M6、M7和M8对EMB敏感。各菌株均可检出IS986序列，耐药菌株可见相关基因的突变，敏感菌株未见基因突变。
2.2 结核分枝杆菌稳定L型
结核分枝杆菌各菌株在不含药物的培养基内培养10～14d后可见L型形成。Mk、M4和M5菌株在含RFP为0.1、0.2和
Mk、M4、M5、M8、M13和M15菌株的药物诱导形成及自发形成的稳定L型染色体DNA经PCR扩增和电泳，可见形成与阳性对照一致的分子量245bp的IS986序列条带。
培养d14，Mk、M4、M5和M13菌株自发形成及RFP诱导形成的稳定L型在含RFP为1、2和
PCR扩增产物 Mk、M4、M5和M13菌株RFP诱导形成及自发形成的稳定L型rpoB基因nPCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳可见形成与阳性对照一致的分子量193bp条带；M5、M8和M15菌株自发形成和诱导形成的稳定L型染色体DNA的katG基因PCR扩增产物，可见形成与阳性对照相同的620bp分子量条带；M2、M4、M5、M6、M7和M8菌株EMB诱导形成及自发形成的稳定L型embB基因nPCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳可见形成与阳性对照一致的分子量233bp条带。
PCR产物的核苷酸序列 Mk、M4、M5和M13菌株RFP诱导形成及自发形成的稳定L型rpoB基因扩增产物测序结果与细菌型一致；M5、M8和M15自发形成及异烟肼诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型的katG基因扩增产物测序结果与其亲代细菌型一致；M2、M4、M5、M6、M7和M8菌株EMB诱导M.tuberculosis形成及自发形成的稳定L型embB基因扩增产物测序结果与细菌型的一致，未发现新的突变位点。
3 讨论
细胞壁缺陷变异是细菌细胞壁的合成受到抑制或其完整性受到破坏，细胞丢失细胞壁结构或停止细胞壁合成的一种生存逃逸现象。由于细胞壁缺陷细菌在不含诱导剂的环境中常常可重新合成细胞壁而恢复与其亲代细菌一致的各种性质，因此认为细胞壁缺陷变异属于非遗传性的形态变异［5］。然而近年的研究［6］证实，完全丧失细胞壁的稳定L型常常难以重新合成细胞壁，从而成为可表达某些新的遗传性状的稳定L型菌株。本文结果显示，细胞壁缺陷结核分枝杆菌的细胞体积增大，主要表现为圆球、卵圆及不规则形态。结核分枝杆菌稳定L型在苏通培养基内能够以出芽方式繁殖和传代培养，但生长速度较其亲代细菌型明显缓慢。
细菌的耐药性变异是细菌最常见的变异现象，细菌耐药性的形成与转移对临床治疗可产生严重的影响。文献［5］认为，细菌耐药性的形成既可以由于抗性基因转移或突变所致的遗传性机制，也可以由于细菌代谢活性降低、丧失抗菌药物作用的靶位以及抗菌药物不能穿过细菌寄生细胞的膜所致的非遗传性机制。细胞壁缺陷造成细菌丧失了抗生素作用的靶位，因此可对青霉素等干扰细胞壁合成的抗菌药物形成非遗传性耐药性。本文结果显示，不论自发形成还是抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型均表现出相似的利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性。采用基因检测与分析方法证实，这些稳定L型不但仍然保留了与其亲代细菌型一致的IS986序列，而且其染色体上耐药性相关的rpoB、katG、embB基因也没有发生突变。提示细胞壁缺陷并不对结核分枝杆菌染色体上IS986序列以及耐药相关基因产生影响，其所导致结核分枝杆菌形成的利福平、异烟肼和乙胺丁醇耐药性可能与细菌代谢活性以及某些代谢机制改变有关。结核分枝杆菌不但可由于染色体上耐药相关基因突变而形成遗传性耐药性，而且也可由于细胞壁缺陷及其所导致的代谢活性与机制改变而形成非遗传性耐药性。
通常认为［5］，细菌在干扰细胞壁肽聚糖合成或破坏细胞壁结构的抗生素等因素的作用下，可发生细胞壁缺陷和形成L型。但近年的研究［6］证实，细菌也可在自然生长繁殖的过程中以及在干扰其他代谢环节的因素作用下发生细胞壁缺陷和成为L型。抗结核药物的作用机制主要是干扰蛋白质、核酸、糖及脂的代谢，因此认为对进行活跃代谢活动的结核分枝杆菌具有明显的抑制或杀灭作用。已知利福平的抗菌机理是抑制依赖DNA的RNA多聚酶活性，阻止结核分枝杆菌mRNA的合成；异烟肼能够抑制分枝菌酸的合成，影响结核分枝杆菌细胞壁的结构；乙胺丁醇可干扰阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的合成，导致结核分枝杆菌发生细胞壁缺陷。本文结果显示，结核分枝杆菌不但能够在常规的苏通培养基内自发形成L型，而且也可在利福平、异烟肼、乙胺丁醇的作用下迅速形成L型并且获得耐药性。提示结核分枝杆菌是容易发生细胞壁缺陷的细菌，其可在许多因素的作用下发生细胞壁缺陷变异和成为L型。L型的产生使结核分枝杆菌迅速形成对利福平、异烟肼、乙胺丁醇的耐药，这样不但可导致临床抗结核药物治疗无效，而且也可导致病原学检查以及耐药性基因检测与分析的漏诊或误诊，从而造成结核分枝杆菌在宿主体内潜伏存在和形成结核的潜在带菌者与传染源。
