【摘要】  目的研究5种中草药对致病弧菌的抑菌活性，为水产品的安全用药提供参考。方法 采用纸片法和试管法，以溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)为供试菌株，测定中草药不同极性萃取部分的抑菌圈和最小抑菌浓度。 结果 夹竹桃叶、芒果叶、苦楝叶和羊蹄甲叶4种中草药乙酸乙酯萃取部分对供试弧菌有很好的抑菌作用；苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取部分对副溶血弧菌有抑菌作用；芒果叶的水溶性部分对塔氏弧菌有很强的抑菌作用；枇杷叶提取物对4株弧菌均无抑制作用。结论 除枇杷叶外，其他4种中草药可不同程度的抑制致病弧菌的生长，其抑制致病弧菌的活性成分有待于进一步研究。

【关键词】  中草药；弧菌；抑菌活性；最小抑菌浓度

　　Study of the antibacteria activity of the extracts from the leaves of five herbs

　　GUAN Shuyu, LIN Jiaqin, ZENG Yu, LIU Guangfeng

　　（1.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou,Guangdong 510006；2.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou,Guangdong 510300,China）

　　Abstract:Objective To study the antibacteria activities of five herbs, to provide references for the safe drugs of aquaculture. Methods  Using Vibrio coralliilyticus, Vibrio tubiashii, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio carchariae as the tested bacteria, the inhibition zone and the minimal inhibitory concentration（MIC）were measured. Results  The extracts, extracted with ethyl acetate from the leaves of Nerium indicum Mill., Mangifera indica Linn., Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea could inhibit vibrio. And the extracts, extrated with petroleum ether from leaves of Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea can inhibit Vibrio parahaemolyticus, too. The remainder extracts of Mangifera indica Linn.showed strong inhibition effect on Vibrio tubiashii. While the extracts of Eriobotrya japonica showed no inhibition effect. Conclusion  Four of the five herbs show antibacteria activities and the study on active compounds should be done in future. 

　　Key words:herb；Vibrio；antibacteria activity；minimal inhibitory concentration
  
　　随着现代集约化和规模化水产养殖的发展，养殖中水产动物感染细菌的几率大大增加。为了预防水产动物疾病，大量抗生素类药物被用作水产药物。滥用抗生素使致病菌的耐药性增加，药物的有效性降低，同时也加剧了环境污染，残留药物降低了水产成品的品质，引发了市场对水产品安全性的质疑，降低了水产商品在国际贸易中的竞争力。因此，开发替代抗生素的高性能、无毒副作用、安全高效的抑菌药物引起了广大科研人员的关注。

    本研究以夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）和枇杷（Eriobotrya japonica）等5种中草药为研究对象，选取对水产品危害较大的4株致病弧菌为实验菌株，旨在通过抑菌活性的筛选研究，获得安全有效的天然抑菌药物。

　　1  材料与方法

　　1. 1  仪器及试剂
   
　　主要仪器有DFT200型摇摆式高速中药粉碎机（温岭市大德中药机械有限公司）、RE52CS型旋转蒸发器（上海亚星生化仪器厂）、LDZX40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、150A生化培养箱（金坛市迅生仪器厂）、SWCJ1D型洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）。所用试剂均为分析纯。使用的培养基为2216E培养基。环丙沙星纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

    供试菌种：溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)由南海水产研究所提供。

　　1. 2  供试药材及预处理

    供试药材为广东常见的5种植物的叶，供试的5种植物分别是夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）、枇杷（Eriobotrya japonica）。5种供试植物均采自广东药学院药用植物园，原植物均经药用植物教研室严寒静副教授鉴定。供试植物叶片阴干后粉碎成粗粉备用。取供试药材粗粉各20 g，用60%（φ）乙醇回流提取90 min后滤过，滤液减压浓缩至50 mL后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取。将3种萃取液分别减压浓缩至1 g/mL（以生药计），即得石油醚萃取部分（Ⅰ）、乙酸乙酯萃取部分（Ⅱ）和水溶部分（Ⅲ）。

　　1. 3  病原菌的分离和菌悬液制备［1］

    将4株供试菌分别划线接种于平皿培养基中，于28 ℃培养24 h后，挑选单个菌落转接于斜面培养基中，28 ℃培养24 h后，用2 mL 0.9% NaCl溶液进行洗脱即制得所需菌悬液。

　　1.4  纸片法抑菌试验

    按无菌操作规程［2］，吸取4株供试菌悬液各0.1 mL，分别加到平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸蘸定量药液的滤纸片（直径为5 mm）平贴在含菌培养基上。同时用浸有相应溶剂的滤纸片做对照。每份样品做3份，结果取平均值。28 ℃倒置培养，并于12 h和24 h观察抑菌效果，测定抑菌圈的直径。以环丙沙星为阳性对照。

　　1.5  试管稀释法测最低抑菌浓度

    采用试管稀释法，以相应溶剂作对照，测定有抑菌活性的药液的最低抑菌浓度(MIC)。每种提取物为一组，每组取无菌试管12支，于第1管中加入1.0 mL浓度为2×105 CFU(colony forming units)/mL的菌液，在2～10管中每管加入1.0 mL 浓度为1×105 CFU/mL菌液，在第1管内加入中药浓缩液1.0 mL，充分混匀后取1.0 mL放入第2管，混匀后再取1.0 mL放入第3管，第1管内的药物浓度为原液的1/2，第2管为第1管的1/2，其余类推，直至第10管，每种药物的第11管作菌液对照（仅加菌液不加中药），第12管作药物对照（仅加中药不加菌液），以能抑制细菌生长（培养后培养基仍清亮）的最小药物浓度为其MIC。

　　2  结果与分析

　　2.1  纸片法抑菌试验结果 

　　见表1。由表1数据可知，阳性对照环丙沙星对4株菌均有抑制作用，而中草药提取物只对溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌和塔氏弧菌3株菌产生抑制作用。其中，夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶对副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌有抑制作用；芒果叶对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有抑制作用；枇杷叶对4株供试致病菌均无抑制作用。比较不同提取部位抑菌作用可知，乙酸乙酯提取部分的抑菌活性较明显，苦楝叶、芒果叶、夹竹桃叶和羊蹄甲叶乙酸乙酯萃取部分均产生抑菌圈；石油醚萃取部分的抑菌结果显示,苦楝叶、羊蹄甲叶石油醚提取部分能产生抑菌圈；水溶性部分只有芒果叶产生抑菌圈。分析不同供试菌敏感性发现，副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌两株供试菌对夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶提取物均敏感，能产生不同大小的抑菌圈；塔氏弧菌只对芒果叶的水溶性部分敏感；鲨鱼弧菌对中草药提取物则完全不敏感。表1  5种植物不同萃取部分的抑菌圈（略）注：石油醚萃取部分简称为I,乙酸乙酯萃取部分简称II,水溶部分简称III。

　　2.2  试管稀释法测定最低抑菌浓度结果   

　　见表2。由MIC数据可知，芒果叶提取物对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌的MIC最低，表明芒果叶提取物在质量浓度为12.5 mg/mL（以生药计）时即可完全抑制两菌的生长。苦楝叶和羊蹄甲提取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC均为50.0 mg/mL（以生药计），夹竹桃对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC为25.0 mg/mL（以生药计）。其他组分的MIC均大于200 mg/mL。表2  5种植物不同萃取部分的最小抑菌浓度（略）注：“+”表示MIC＞200 mg/mL

　　3  讨 论
   
　　弧菌（Vibrio）因菌体有一个弧状弯曲而得名，广泛分布于自然界中，水环境中较多，对人、鱼、蛙及其他动物均有致病性，其中霍乱弧菌和副溶血弧菌是引起人类细菌性食物中毒的首要食源性致病菌。目前，从海水、淡水和养殖水体中分离鉴定出弧菌（Vibrio）共有100多种，其中多数是致病菌，严重危害人类的食品安全。本研究所用供试菌鲨鱼弧菌和副溶血弧菌也是《美国临床微生物手册》记载的人类致病菌。通过研究发现，鲨鱼弧菌对5种中草药均不敏感，而其他3种致病弧菌均有敏感中草药，说明该菌具有对抗普通抑菌药物的生长机制，应对其机理展开进一步的研究。
   
　　本研究所选5种中草药是我国岭南地区资源丰富、广泛易得的药材。本研究结果表明，除枇杷叶外，其他4种均有抑制致病弧菌的作用。比较文献结果发现，夹竹桃粗提物对大肠杆菌、粪肠球菌等的MIC为0.5 g/mL［3］，本研究结果表明夹竹桃乙酸乙酯萃取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的MIC仅为25mg/mL。MIC结果差异的产生可能与以下2个因素有关：①菌种不同，敏感性不同。本研究采用的是水产养殖中的致病弧菌，而文献所用供试菌为杆菌和球菌；②药材的提取方法不同，本研究采用粗提后再萃取的方法处理药材，一定程度上精制了样品，去除了干扰，而文献中药物的处理方法仅为水提处理。本研究中，芒果叶的乙酸乙酯萃取物和水溶性部分分别对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有较好的抑菌作用，说明萃取法可以有效地将不同活性的成分分开，比较文献所用的水煎煮法［4］，萃取法的优势在于将不同极性的成分进行了粗分，为进一步研究活性成分提供了依据。实验结果表明，苦楝叶和羊蹄甲叶分别对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌具有较好抑菌作用，苦楝叶的抑菌功效与其清热燥湿的作用相符合，而羊蹄甲根的抗菌活性成分已被分离获得［5］。
   
　　此外，本研究采用环丙沙星为阳性对照药，实验发现环丙沙星对4株弧菌有广泛且明显的抑菌作用，说明该4株菌对环丙沙星较敏感且没有产生耐药性。虽然环丙沙星对4株弧菌的抑菌作用优于中草药提取物，但由于其成分和作用机理单一，临床上已有耐药菌出现。因此，不宜在水产养殖过程中长期用药。相比之下，中草药提取物由于成分复杂，作用机理不统一，较难产生耐药菌，有较高的实际应用价值，有必要进一步开发。

【参考文献】
  　　［1］刘广锋，周世宁，徐力文，等. 杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析［J］. 中国水产科学，2006:13(4)：655-661.

　　［2］俞树荣. 微生物学和微生物学检验［M］. 2版. 北京：人民卫生出版社，1997：452-457.

　　［3］谭宏亮，黎鹄志. 夹竹桃叶水提取物抑菌作用研究［J］. 宜春学院学报，2007，29(4)：70-71.

　　［4］谢金鲜，林启云，李爱媛. 复方芒果叶的薄层层析及抗菌试验［J］. 福建中医药，2001，32（2）：41-42.

　　［5］BOONPHONG S, PUANGSOMBAT P, BARAMEE A, et al. Bioactive compounds from Bauhinia purpurea possessing antimalarial, antimycobacterial, antifungal, antiinflammatory, and cytotoxic activities［J］. J Nat Prod, 2007,70(5):795-801

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