抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
管碟法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
（一） 基本设备、用具、试验材料及标准品
1. 基本设备
（1） 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。
（2） 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。
（3） 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。
2. 用具
（1） 玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。新购的双碟应按上述要求进行检查。检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。
（2） 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。
（3） 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。
（4） 小钢管放置器：四孔和六孔各一台。
（5） 游标卡尺：精密度0.02mm。
（6） 滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。
3. 试验材料
（1） 培养基及其制备方法
以下培养基、缓冲液制备时，均以115℃灭菌30分钟。
培养基 Ⅰ
胨 5g 磷酸氢二钾 3g 水 1000ml 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g
除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过（用纸浆减压滤过或纱布棉花滤过），调节PH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6，分装，灭菌。
培养基 Ⅱ
胨 6g 酵母浸出粉 6g 琼脂 15~20g 牛肉浸出粉 1.5g 葡萄糖 1g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为7.8~8.0或6.5~6.6，分装，灭菌。
培养基 Ⅲ
胨 5g 氯化钠 3.5g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸氢二钾 3.68g 水 1000ml
酵母浸出粉 3g 磷酸二氢钾 1.32g
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为7.0~7.2，分装，灭菌。
培养基 Ⅳ
胨 3g 酵母浸出粉 3g 水 1000ml 葡萄糖 1g 琼脂 15~20g
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使其比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为6.5~6.6，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基 Ⅴ
胨 6g 酵母浸出粉 2g 琼脂 15~20g 牛肉浸出粉 2g 葡萄糖 3g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使其比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为7.8~8.0，分装，灭菌。
培养基 Ⅵ
蛋白胨 7.5g 牛肉浸出粉 1.0g 葡萄糖 10.0g 酵母膏 2.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节ＰＨ值使灭菌后为6.5，分装，灭菌。
营养琼脂培养基
胨 10g 琼脂 15~20g 氯化钠 5g 肉浸液 1000ml(牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替)
除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节PH值使灭菌后为7.2～7.4，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。
改良马丁琼脂培养基
胨 5.0g 葡萄糖 20.0g 水 1000ml 硫酸镁 0.5g 酵母浸出粉 2.0g 磷酸氢二钾 1.0g 琼脂 15～20g
除葡萄糖和琼脂外，混合上述成分，微温溶解，调节PH值约为6.8，加入琼脂，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
注意事项：①制备培养基的原材料，特别是胨、牛肉浸膏和琼脂等对抑菌圈的大小与边缘的清晰度有影响，故应预先进行试验，挑选使用。②不得在操作抗生素的实验室内配制培养基。配制培养基所用的器皿应与接触抗生素的器皿严格分开，以免污染抗生素。③培养基中的琼脂用量要随气候冷暖不同而增减。一般夏季用琼脂的量比冬季多，其用量多少以培养基的硬度适宜为度。④培养基在加热煮沸后所蒸发的水分必须用蒸馏水补足。⑤培养基灭菌后，应放于37℃培养箱中培养24～48小时,证明无菌后方可使用。使用期限约为1个月，不宜保存过久，以免营养价值降低。⑥制成的培养基倒入双碟内凝固后应透明，不得有沉淀。
（2） 缓冲液
磷酸盐缓冲液（PH6.0）：取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml,滤过，
分装，灭菌。
磷酸盐缓冲液（PH7.0）：曲磷酸氢二钠9.39g与磷酸二氢钾3.5g,加水使成1000ml，
滤过，分装，灭菌。
磷酸盐缓冲液（PH7.8）：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，
滤过，分装，灭菌。
[附注]配制缓冲液所用化学试剂的规格应为分析纯试剂。
（3）试验用菌种：试验用菌种对被测定的抗生素应具有高度的敏感性，在一般培养基上能生长繁殖，易于保存，不应变异或变异性小，无致病性，具有敏锐的生化培养特性，能适合多种抗生素的检定，最好是芽胞菌，因芽胞菌制备成悬液易于保存，不易变异，使用时间长。
①试验用菌种的保存：卫生部药品生物制品检定所提供的菌种为冷冻干燥菌种，可保存在5℃的冰箱内。以无菌操作启开冻干菌种，接种在普通琼脂斜面上，置37℃培养箱中培养20～22小时。取出放至室温后，放入5℃冰箱中保存，即为试验用菌种。试验用菌种每月传代一次，每季度平板分离一次。
②菌种的接种方法：从冰箱中取出菌种1支，放至室温。另取新鲜制备的普通琼脂斜面1支（如琼脂斜面已干燥无凝结水者，则不可使用），注明菌名、接种日期，与菌种斜面一同放于预先用1‰新洁尔灭溶液擦拭过，并用紫外线灯照射30分钟后的工作台上（或超净工作台内）。操作人员用新洁尔灭溶液洗手，然后按无菌操作要求开始接种。先将菌种斜面和待接种的培养基斜面试管口上的棉花塞通过酒精灯火焰稍稍扭动一下，以免接种时不易拔出棉塞。用左手握住菌种斜面和待接种的培养基斜面，将试管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，在火焰上将接种环烧红约30秒钟，然后将全部金属棒通过火焰往返3次，用右手无名指及小指同时将菌种斜面和待接种的培养基斜面试管口的棉塞拔出，并将两支试管口在火焰上通过一下，立即将接种环伸入菌种斜面管内，先在近管壁的琼脂培养基表面上靠一下，使稍冷却，再移至菌苔上刮取少量菌苔，迅速将接种棒取出，并立即伸入到待接种的培养基斜面管内，由下至上在培养基斜面上轻轻曲折移动1次，取出接种棒，立即在火焰旁将原来的棉塞塞上，然后将接种棒上的残余细菌在火焰上烧灼，烧灼时应先将接种环离沾菌处的远端烧灼，使其传热至沾菌处，待菌苔已枯焦、炭化后，才能直接烧灼，切不可直接猛火烧灼沾菌处，以防细菌溅出。接种完毕后，将细菌管置37℃培养箱内培养22～24小时（霉菌管一般置26～27℃培养箱内培养7天）。取出放冷至室温后，放入5℃冰箱中保存。
③试验用菌液的制备和保存
枯草芽孢杆菌悬液 取枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501或CVCC717]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
（取枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml普通琼脂培养基的100ml三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入5%石炭酸消毒液中。将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。置5℃冰箱中保存，可使用6个月。）
短小芽孢杆菌悬液 取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202或CVCC709]的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌悬液 取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003或CVCC1882]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
（取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]试验用菌种斜面1支，用接种棒取培养物接种至10ml培养基Ⅲ中，接种时在靠近培养基液面的试管壁上摩擦，使菌苔均匀混悬于液体培养基中，在35～37℃培养箱中培养16～18小时，取出，应成均匀的悬液，无菌膜及凝集沉淀，此菌液仅供当日使用。）
藤黄微球菌（藤黄八叠球菌）悬液 取藤黄微球菌[CMCC(B)28001或CVCC1600]德营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
（取藤黄八叠球菌[CMCC(B)28001]试验菌种斜面1支，加入2ml培养基Ⅲ，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml普通琼脂培养基的100ml三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入5%石炭酸消毒液中，将已接种的三角瓶置26～27℃培养箱中培养24小时，用5ml培养基Ⅲ将菌苔洗下制成均匀的悬液。此悬液在5℃冰箱中保存可使用1个月。）
大肠杆菌悬液 取大肠杆菌[CMCC(B)44103或CVCC2801]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
（1） 双碟的制备：取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，用灭菌大口吸管
分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得到清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），充分摇匀，用灭菌大口吸管在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。
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