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病毒RNA传统提取方法



录入时间:2010-10-28 10:35:51 来源:生命经纬

一、细胞的裂解

1、单层细胞的裂解

a)吸出培养液,以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞,重复1次,将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上,再将铝板置于冰盘上。

b)直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液,并使之遍布整个平板的表面。(RNA提取缓冲注液配方:0.14mol/L NaCl,1.5mmol/L MgCl2,10mmol/L Tris.Cl(pH8.6),0.5NP-40,1mmol/L二硫苏糖醇(DTT),100单位/ml RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物。)

c)加0.5ml蛋白酶消化缓冲液,用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。(蛋白酶消化缓冲液配方:0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0),25mmol/L EDTA(pH8.0),0.3mol/L NaCl,2 SDS

d)用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物,再将其注入聚丙烯管内。重复34次,剪切DNA。

e)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37温育30分钟。蛋白酶K以贮存液的形式保存,贮存液为20mg/ml蛋白K溶液。

2、悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解

a)于42000g离心5分钟收集细胞,以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀,洗涤细胞3次,每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀,使其彻底分散。

b)估计细胞沉淀的体积,用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。

c)加入与步骤b)所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液,用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物,再将其注入聚丙烯管内。重复34次,剪切DNA。

d)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存,贮存液为20μg/ml蛋白酶K水溶液。

二、提取步骤

1、用等体积酚:氯仿抽提1次,以去除蛋白质。

2、用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相, 将水相吸至一个新的离心管内,加2.5倍体积用冰乙醇,充分混匀, 0放置1小时。

3、于45000g离心10分钟沉淀RNA,弃上清,用含0.1mol/L乙酸钠(pH5.2)的70%乙酸洗涤沉淀,用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽, 随后于室温放置几分钟,晾干沉淀。切勿抽干沉淀,因为干的核酸沉淀很难溶解。

4、每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl(pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。

5、分别按10mmol/L0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇(DTT),然后分别按1000单位/10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。

6、加入无RNA酶的胰DNAI至终浓度为2μg/ml,混匀,于37温育60分钟。

7、分别按10mmol/L0.2%的终浓度加EDTASDS。

8、用等体积酚:氯仿抽提1次。

9、于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相, 将水相吸至另一个离心管内,加3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L,加2.5倍体积用冰预次的乙醇,充分混匀,冰浴放置2小时。

10、用微量离心机于412 000g离心5分钟沉淀RNA。

11、吸出所有的乙醇,将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟,让最后残存的痕量乙醇挥发干净。

12、用200μl TEpH7.6)重溶沉淀,加500μl乙醇,于-70 贮存备用。回收DNA时,只须取出1小份贮存液,加入3mol/L乙酸钠(pH5.2 )至终浓度为0.3mol/L,充分混匀,用微量离心机于412 000g离心5分钟即可。

三、注意事项

1、测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液离心沉淀RNA,以400水重溶,测定OD260值,OD2601RNA溶液每毫升约含40μg RNA。

2、如果需要,可用oligo(dT)-纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。

3、某些情况下(例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时),必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则,当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题,反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物,从而导致物定mRNA5'末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。

a)步骤12后,加200μl 3mol/L乙酸钠(pH5.2),用自动微量移液器反复吹吸,以重悬核酸沉淀,将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。

b)用微量离心机于室温以12,000g离心10分钟,RNA沉于管底,而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。

c)弃上清液,用200μl TEpH7.6)重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠(pH5.2),分混匀,加入550μl用冰预冷的乙醇。混匀溶液,在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于412,000g离心10分钟,以回收RNA。小心吸出上清。

d)弃上清液,用300μl TEpH7.6)重溶沉淀,加1ml乙醇,-70贮存备用。

回收RNA时,只需取出1小份贮存液,加3mol乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L充分混匀,用微量离心机于412 000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物,用含0.1%羟喹啉的苯酚[0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]RNA终溶液抽提数次即可。

 

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