食品中大肠菌群两种测定方法的比较

陈海宁（广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室， 广州 510316）

摘　要】　  本文采用国家标准GB/T4789.3-2003大肠菌群测定和GB/T4789.32-2002大肠菌群的快速检测中最可能数（MPN）的方法，检测食品中的大肠菌群，结果显示：381份样品中两种方法对大肠菌群的检测结果相同，合格率均为86.6%，两者符合率100％。
　　【关键词】  　食品，大肠菌群，最可能数（MPN）

前言

　　大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。如果大肠菌群存在于食品中，表明食品未做有效的消毒处理、加工后保存条件不良或消毒后又受到污染。快速检验大肠菌群，有助于食品的卫生管理，维护消费者的健康安全。

　　国标GB/T4789.3-2003大肠菌群测定中乳糖胆盐发酵法是常规三步法：乳糖胆盐初发酵、伊红美蓝培养和乳糖复发酵、革兰氏染色证实试验。由于操作繁琐，费时费力，不太能适应大量检测工作的需求。因此寻找快捷、准确、标准化的大肠菌群测定方法，能够省去了繁杂的试剂配制、分装、消毒等工作，提高了工作效率，符合现代检验向快速、准确方向发展的要求。

1材料与方法

1.1 样品

　　食糖、糖果、饮料、蜂蜜、饼干、果冻、饮用水等7类食品共381份

1.2主要试剂及仪器

　　乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝培养基、革兰氏染色剂、MUGal肉汤、366nm紫外线灯。

1.3试验方法

　　以无菌操作将检样25g放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液，用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。

1.3.1GB/T4789.3-2003中乳糖胆盐发酵法

1.3.1.1发酵试验

　　将待检样品稀释液（液体饮料和饮用水用原液）接种于乳糖胆盐发酵管内，前排三大管为双料发酵管，内接种1：10的均匀稀释液（液体饮料和饮用水原液）10mL，后排共六管，为单料发酵管，其中三管接种1：10的均匀稀释（液体饮料和饮用水原液）1mL，另外三管接种1：100的稀释液（液体饮料和饮用水1：10的均匀稀释液）1mL，另取2支乳糖胆盐发酵管（或双料乳糖胆盐发酵管），加入与样品稀释液等量的上述无菌生理盐水作空白对照。将接种好的培养管置于36±1℃温箱内，培养24±2h后，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则可报告为大肠菌群阴性，如果培养基变黄，产气窗内有气泡者，为产酸产气，则进行证实试验。

1.3.1.2证实试验

　　将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。根据大肠菌群阳性管数，查MPN表，报告每100ml（g)食品中大肠菌群MPN值。

1.3.2 GB/T4789.32-2002中MUGal肉汤法

　　将上述1.3.1.1接种培养液改为MUGal肉汤，其他步骤相同。另取2支MUGal肉汤管（或双料MUGal肉汤管），加入与样品稀释液等量的上述无菌生理盐水作空白对照。将接种后的培养管置于37±1℃温箱内，培养18～24 h。将培养管置于暗处，用波长366nm紫外线灯照射，如显蓝色荧光，则为大肠菌群阳性管；如未显蓝色荧光，则大肠菌群阴性管。根据大肠菌群阳性管数，查MPN表，报告每100ml（g)食品中大肠菌群MPN值。

2结果与讨论

2.1试验结果如表1和表2所示。

采用国家标准GB/T4789.3-2003大肠菌群测定和GB/T4789.32-2002大肠菌群的快速检测中最可能数（MPN）的方法，对食糖、糖果、饮料、蜂蜜、饼干、果冻、饮用水等7种食品381份样品进行大肠菌群检测，结果显示：检验合格的样品均为330份，两种方法对样品检验的合格率相同，均为86.6%，两者合格符合率100％；两种方法对大肠菌群的检测结果相符的有365份，符合率95.8％；不合格的51份样品有16份的结果略有不同，占所有样品的4.2%。

表1 食糖、糖果、蜂蜜、饼干和果冻的乳糖胆盐发酵法和MUGal肉汤法测定结果比较

表2 饮料和饮用水的乳糖胆盐发酵法和MUGal肉汤法测定结果比较

表3乳糖胆盐发酵法和MUGal肉汤法测定结果合格率比较

2.2  GB/T4789.3-2003大肠菌群测定中乳糖胆盐发酵法是根据大肠菌群分解乳糖胆盐中的乳糖，产酸产气，并且使伊红美蓝培养基中伊红与美蓝结合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，在实际工作中，熟悉大肠菌群菌落特征色泽和形态，对检出率影响很大。为了避免假阴性的判断，通常需要多挑菌落，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。判断受影响的因素比较多，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性，因而造成工作量加大。对可疑菌落的选择和判断非常重要，因此这种检验方法对检验人员的操作经验和熟练程度要求比较严格。　　

　　GB/T4789.32-2002大肠菌群的快速检测中最可能数（MPN）的方法，是根据大肠菌群可产生β－半乳糖干苷酶，分解液体培养基MUGal肉汤中的酶底物――4-甲基伞型酮－β－D－半乳糖苷(简称MUGal)，使4-甲基伞型酮游离，因而在366nm的紫外线灯照射下呈现蓝色荧光，能够更直接得出结果，省去进一步的证实试验，因此从培养到报到结果的时间可缩短为18～24 h，同时能够避免假阴性的出现。

2.3  国标GB/T4789.3-2003大肠菌群测定乳糖胆盐发酵法是常规三步法，由于操作繁琐，费时费力，不太能适应大量检测工作的需求。快速检测能使原来的检测周期由72小时缩短到18小时，同时大大简化操作程序。MUGal肉汤试剂保存期限较长，操作方便，从培养到鉴定的时间相对缩短，有利于生产上的在线分析，及时了解食品指标的情况，发现问题能及时给予调整。MUGal肉汤法与常规的GB/T4789.3-2003大肠菌群测定乳糖胆盐发酵法所采用的均为九管法，更有利于在结果上作比较。

2.4  大肠菌群的检验方法除了国家标准方法规定常规的乳糖胆盐发酵法，快速检测的MUGal肉汤法，还有一些其他方便快捷的方法，如采用平板显色培养基，其结果只能反映食品中的细菌状况，但由于方法所得出的单位与国标有所不同，一般得出的直接结果是每克或每毫升的大肠菌群数，而现在大多数食品标准中，大肠菌群的指标是以九管法得出的最可能数（MPN）即个/100mL为单位，所以平板法难以与常规三步法难以作出直接比较，只适宜食品生产企业在自主生产过程中的自主检验。

参考文献
[1] GB/T4789-2003。中华人民共和国国家标准，食品卫生微生物学检验；
[2] （英）W.F.Harrigan著，李卫华等译  食品微生物实验室手册（第三版）中国轻工业出版社 2004，111，115
[3]罗雪云，刘宏道  食品卫生微生物检验标准手册: ［M］.北京:中国标准出版社,1995:18～25

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