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农杆菌介导的植物遗传转化



录入时间:2010-10-27 9:05:18 来源:西北农林科技大学

    (一)实验目的
  1.全面了解农杆菌介导的植物转基因的方法;
  2.根据已学的知识,设计一个农杆菌介导植物的遗传转化实验方案;
  3.掌握农杆菌培养,植物外植体无菌系建立,农杆菌侵染和转化体筛选等一系列试验方法。
  (二)培养基
  1LB培养基:每升含有:酵母浸膏 5 g , 胰蛋白胨 10 g ,NaCl 5 g ,PH 7.2
  2YEB培养基:每升含有:牛肉浸膏 5 g ,酵母浸膏 1 g ,蛋白胨 5 g ,蔗糖 5 g ,MgSO4·H2O 0.5 g ,PH 7.0

3YEP培养基:每升含有:牛肉浸膏 10 g ,酵母提取液 10 g ,NaCl 5 g ,PH 7.0

4.实生苗培养基: 1/2MS培养基,附加30g蔗糖和0.6%琼脂,PH=6.0。
  5.预培养基:MS+1.01.2mg/L  2,4-D+0.2mg/L 6-BA+30g蔗糖+6g琼脂,PH=5.8。
  6.分化培养基:MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+30g蔗糖+6.5g琼脂+AgNO36mg/L, PH=5.8。
  7.筛选培养基:分化培养基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L Kan,PH=5.8。
  (三)试验仪器
  超级超净工作台
  智能气候培养箱
  大型落地式高速冷冻离心机
  凝胶成像系统
  台式常温高速离心机
  立式灭菌锅
     
电泳相关设备
  (四)农杆菌介导植物转化实验步骤(以油菜子叶转化为例)
  1.根癌农杆菌的培养
  将保存于甘油中的菌种用划线法接种于LB固体平板培养基上培养,每次转化前一天从平板上挑取单菌落接种于YEB液体培养基中,在26℃,170r/min的摇床上过夜培养,当OD600值达0.30.5时,将其在4000r/min的条件下离心5min,弃去上清,然后用液体MS培养基将其重悬稀释58倍待用。

2.建立无菌苗
  将油菜种子用75%酒精浸泡30s后,于0.1%HgCl2溶液中处理10min,无菌水冲洗3次后,接种于1/2MS固体培养基上,在25±1℃黑暗条件下培养3d,后移至光下培养13d,取其下胚轴和带柄子叶接种在预培养基上,在25℃,光照强度为2000lux,16h光照周期培养条件下培养,待用。
  3.农杆菌侵染
  在无菌条件下,将预培养2d子叶和下胚轴收集于一个无菌小烧杯中,浸入于活化并稀释了58倍的农杆菌液中,5min后转到无菌滤纸上,吸干多余的菌液,接至共培养培养基中,在25℃生化培养箱中共培养2 d。
  4.分化培养 
  将共培养2d的受体材料先用无菌水冲洗23次至水澄清后,用500mg/LCef浸泡3040min,材料取出并置于含有无菌滤纸的培养皿中干燥2d。将培养物转移至附加815mg/L卡那霉素和500mg羧苄青霉素(或头孢霉素)的分化培养基中,在25℃,昼夜光周期为168h恒定光照条件下培养,
  5.筛选培养
  将分化培养中获得的绿芽移置筛选培养基(卡那霉素浓度升致25mg/L),每隔1520d转接一次。
 

 

 

 

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