青霉遗传转化系统的研究进展
邢 伟（西南大学药学院，重庆 400716）
【摘 要】 青霉在自然界中是普遍存在的,在工业、农业和医药领域有着重要的应用和研究价值。有关青霉的遗传转化体系已经建立。本文就青霉的转化方法、转化载体启动子的选择、选择性标记，及其在青霉研究中的应用进行了综述。
【关键词】 青霉，遗传转化，载体
青霉是真菌中的一大类群,包括一些重要的工业生产微生物，能够产生许多有生物活性的小分子次级代谢产物，如青霉素。但是，这些活性物质是微生物发酵的次级代谢产物，其产量往往较低，因此需要通过改良菌种等策略来提高其产量。分子生物学、基因工程技术的发展，为构建基因工程菌株提供了可能，给菌种改良工作带来了更加直接的有效的方法。
遗传转化是人们进行菌种改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途径。自1973年Mishra 和Tatum首次报道粗糙脉孢菌转化以来[1]，丝状真菌遗传转化系统研究发展非常迅速，丝状真菌的遗传转化系统已基本建立。关于青霉属真菌的遗传转化也有报道。本文着重在青霉属丝状遗传转化系统的最新进展方面作一介绍。
1 转化方法
1.1 原生质体转化方法
采用酶法消化细胞壁制备原生质体，利用原生质体作为外源基因的受体细胞，是克服细胞壁障碍的有效方法之一。目前常用的细胞壁裂解酶为 Novozyme 234、纤维素酶和蜗牛酶等。Nara等人[2]已经建立了美伐他汀产生菌桔青霉的原生质体转化系统。而且，他们发现原生质体转化效率受到包括PEG、二甲基亚砜(DMSO)和肝素等多种因素的影响。PEG的浓度对于转化效率有显著的影响，而且是非线性关系。与PEG4000相比，PEG8000更有利于转化效率的提高。DMSO对转化具有抑制作用，肝素则能显著促进转化。另外，在其他青霉种属中，相应的原生质体转化体系也已建立。如产黄青霉[3]、草酸青霉P8[4]、微紫青霉菌[5]。
1.2 农杆菌介导的青霉遗传转化方法
农杆菌介导转化方法ATMT 最初多用于植物遗传工程。近来ATMT转化技术已扩展到丝状真菌，Groot等[6]利用ATMT成功转化了多种丝状真菌。
在青霉中，孙传宝等人[7]利用ATMT方法，通过根瘤农杆菌LBA4404 Ti质粒介导建立一个高效的产黄青霉遗传转化体系。利用根瘤农杆菌介导转化产黄青霉孢子时需要有乙酰丁香酮诱导，但转化菌丝体时乙酰丁香酮不是必要的, 但一定浓度的乙酰丁香酮可提高转化率。与原生质体转化法相比可提高转化率10倍左右。ATMT转化法获得的转化子在生理特性上原始菌株表型相同。
根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化是近年建立起来的一种新方法,克服了原生质体转化的缺点，农杆菌介导转化法具有四个特点:一是受体来源广泛，原生质体、孢子、菌丝和子实体都可以直接用于转化；二是转化稳定；三是转化效率高；四是单拷贝插入。随着ATMT转化丝状真菌种类逐渐增多，ATMT已经成为丝状真菌遗传转化的重要手段
2 青霉转化载体的选择标记基因
2.1 营养缺陷型互补基因
营养缺陷型互补基因是通过转入的标记基因与受体细胞缺陷基因互补,使受体细胞表现野生型生长而作为选择标记的。目前,常用于青霉转化的营养缺陷型互补基因有产黄青霉的trpC基因（编码色氨酸合成酶）和pyrG 基因（编码尿嘧啶营养缺陷型互补基因）等[8]。由于使用营养缺陷型标记要求有特定营养缺陷型受体菌, 因而限制了这一选择性标记的使用。
2.2 抗生素抗性基因
抗性基因的转入可以使受体细胞在一定的药物浓度下生长，表现出药物抗性,不要求受体菌具有营养缺陷型,使用起来较为方便,促进了药物抗性标记在青霉等丝状真菌转化中的应用。常用抗性标记有：潮霉素抗性基因，腐草霉素（phleomycin）抗性基因，苯菌灵抗性基因(Benr)，博来霉素(bleomycin) 抗性基因。HygB已用于筛选桔青霉和草酸青霉菌P8转化子[2,4],得到了抗药性稳定的转化子。Benr用于微紫青霉菌菌株GXCR的遗传转化[5]。博莱霉素和腐草霉素抗性基因在产黄青霉中得到应用[3,7]。
2.3 绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白GFP是从水母体内发现的一种发光蛋白绿光，这种发光的标签已广泛应用于遗传学，生化学和分子生物学。张磊等人[4]构建了绿色荧光蛋白和潮霉素抗性双标记载体转化草酸青霉菌P8，筛选出稳定、高效表达GFP并对潮霉素产生抗性的转化菌株。
3 青霉转化载体启动子的选择
由于启动子在不同生物间的种属差异，载体中的真核启动子必须是来源于受体菌自身或相近种属。
目前，用于青霉转化的真核启动子主要有：来源于构巢曲霉的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA、色氨酸合成基因trpC的启动子PtrpC[9]和磷酸甘油酸激酶启动子Ppgk[2],来源于泡盛曲霉的谷氨酸脱氢酶启动子Pgdh[8]，粗糙脉胞霉氨基酸合成交叉途径控制基因cpc的启动子Pcpc[9]，产黄青霉异青霉素N合成酶（IPNS）基因pcbC的启动子Pipns[9]。这些启动子在青霉中均有活性，但是它们启动基因表达的能力有较大差异。任志红[9]等对几种启动子在产黄青霉中效率评价,结果发现四种启动子的强弱的顺序为PgpdA>Pcpc>Pipns>PtrpC,研究结果也表明选择性标记基因受强启动子驱动可以提高产黄青霉工业生产菌种的转基因效率。
4 青霉遗传转化系统的应用与展望
青霉遗传转化系统的建立为人们从基因水平研究丝状真菌的基因功能和菌株改造提供了条件,通过转化把外源基因导入丝状真菌细胞,构建基因缺失突变体或高表达菌株，来分析基因的功能及其表达调控机理，以及改良工业业生产菌株。例如，在桔青霉中[10-11]，通过遗传操作，对美伐他汀生物合成基因簇中的各个催化步骤相关酶基因功能研究及其途径特异性调控因子MlcR的功能研究，及高产基因工程菌的培育。通过构建laeA基因沉默或高表达菌株，研究表明全局性调控因子laeA对产黄青霉中青霉素的生物合成有正调控作用[8]。
参考文献
[1]Mishra N C and Tatum E L.Non-Mendelian inheritance of DNA-induced inositol independence in Neurospora.Tech Tips Online,1973,70:3875-3879.
[2]Nara.F,Watanabe.I,Serizawa.N.Development of a transformation system for the filamentous,ML-236B(Compactin) producing fungus Penicillium citrinum.Current Genetics,1993,23(1):28-32.
[3]王富强,任志红,徐平等.产黄青霉转化载体pPIPKA 的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究[J].菌物学报,2004,23(1):66-72.
[4]张磊，范丙全,黄为一.绿色荧光蛋白和潮霉素抗性双标记载体转化草酸青霉菌P8的研究[J].微生物学报,2005,45(6):842-845.
[5]玉荣,赖洪敏,刘杨等.高抗重金属盐的微紫青霉菌( Penicillium janthinellum)菌株GXCR的遗传转化[J].广西农业生物科学,2008,27(1):31-36.
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[7]孙传宝,朱春宝,朱宝等.利用根瘤农杆菌LBA4404 Ti质粒介导高效转化产黄青霉及克隆vgb基因[J].中国抗生素杂志,2002,27(2):87-92.
[8]Katarina Kosalkova´,Carlos Garcı´a-Estrada, Ricardo V.Ulla´n,et al.The global regulator LaeA controls penicillin biosesynthesis,pigmentation and sporulation,but not roquefortine C synthesis in Penicillium chrysogenum.Biochimie,2009,91(2):214-225.
[9]任志红,徐平,王富强等.产黄青霉工业生产菌种基因报告系统的构建及启动子效率的评价[J].菌物学报,2005,24（3）:376-384.
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