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幽门螺杆菌感染的现行临床诊断检测技术(上)



录入时间:2010-10-25 8:47:50 来源:螺旋杆菌临床研究进展

    慢性胃炎和消化性溃疡是全球性的多发病。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,占全球癌症死亡原因的第二位,我国每年死于胃癌的患者占居恶性肿瘤死亡原因的首位。慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌与幽门螺杆菌感染密切相关。幽门螺杆菌感染是慢性胃炎主要病因(80%~95%),幽门螺杆菌感染几乎无例外地引起胃粘膜炎症,感染后机体一般难以自行将其清除,而造成慢性感染。十二指肠溃疡患者的幽门螺杆菌感染率为90%~100%,胃溃疡为80%~90%。幽门螺杆菌感染与胃癌发病相关,己被WHO列为I类致癌物。在上世纪50年代以前,临床诊断慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌除依据患者的临床表现外,主要靠X线钡餐检查。慢性胃炎患者用气钡双重造影显示胃粘膜的微细结构时,萎缩性胃炎可出现胃粘膜皱襞相对平坦、减少;胃窦胃炎X线征表现为胃窦粘膜呈纯锯齿状及胃窦部痉挛,或幽门前段持续性向心性狭窄,粘膜粗乱等。消化性溃疡的X线直接征象为钡剂填充溃疡的凹陷部分造成的龛影。胃癌的X线征象主要表现为钡剂充盈缺损(息肉样或隆起性病变)、边缘欠规则或腔内龛影(溃疡),和胃壁僵直失去蠕动(癌侵润)等。上世纪50年代日本首先发明内镜,这种内镜利用光导纤维原理,不仅可对胃十二指肠粘膜直接观察,还可在直视下活检作病理检查。

1. 幽门螺杆菌感染的临床检测方法及评价

门螺杆菌(H.pylori)1983年由澳大利亚学者WarrenMarshall首次从胃粘膜中分离出的一种螺旋杆菌,它的发现使人们对慢性胃炎、消化性溃疡等许多胃肠道疾病的发病机制及其治疗的认识发生了革命性的变化。目前幽门螺杆菌的诊断检测方法包括侵入性和非侵入性两大类。侵入性方法需通过内镜获取活组织进行检测,非侵入性方法则不需进行内镜检查。
1.1  
侵入性检测方法
1.1.1 
细菌培养:将胃粘膜活检标本做微需氧环境下培养,如培养出幽门螺杆菌即可诊断为幽门螺杆菌感染。因其特异性高达100%,常被视为幽门螺杆菌感染诊断的"金标准"。可用于验证其它诊断性实验,亦可用于药敏试验、细菌分型、致病基因的研究等。但它是幽门螺杆菌诊断试验中技术要求最高的一种方法,需要经费、时间和人力均较多,因此限止了其临床使用,主要用于科学研究。还应注意,胃粘膜组织中细菌量过少,细菌繁殖能力差等因素可能会影响幽门螺杆菌的培养而导致假阴性。

1.1.2 快速尿素酶试验(RUT):幽门螺杆菌产生的尿素酶,可分解尿素产生NH3CO2,NH3的产生可使pH值升高,胃粘膜组织呈碱性,据此原理可通过加入pH指示剂通过颜色的改变判断有无幽门螺杆菌感染存在。目前已有多种尿素酶试剂盒或试纸可供临床使用,因其操作简便、费用低、省时,成为侵入性检测方法的首选。快速尿素酶试验己有许多方法的改进,如应用化学发光pH指示剂,使结果出现更快,敏感性提高50倍。在内镜检查时使用幽门螺杆菌敏感化学感受检测器,其敏感性92%、特异性95%,且需时仅1min。采用定标的快速尿素酶试验,可测定幽门螺杆菌定植密度,根据黄、绿、淡蓝反应,可对结果进行分级,与组织学方法相比,敏感性和特异性分别为89%88%( 1)。
1.1.3
胃粘膜组织切片染色镜检:将胃粘膜活检组织标本固定、脱水后常规石腊包埋、切片染色、镜下观察,根据幽门螺杆菌的形态学特征进行检测和分折,可以直接观察胃粘膜表面定植的幽门螺杆菌。其染色方法有W-S银染、改良Giemsa染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色等。因染色方法的不同,各有不同的特点,其中免疫组化染色是一个高敏感和特异的染色方法,它是组织学检测的"金标准"( 2)。

1.1.4 胃粘膜直接涂片染色镜检:即将胃粘膜组织直接涂于玻璃片,一般用Gram染色后相差显微镜下观察幽门螺螺杆菌。Piccolomini( 3)]报道了用Leifson鞭毛染色法诊断幽门螺杆菌感染,Leifson鞣酸一品红染色法来做胃活检标本印片细菌学检查,以显示幽门螺杆菌的鞭毛,并与组织学检查、快速尿素酶试验和细菌培养等方法进行比较。Leifson染色法15分可完成,其特异性和敏感性与其它检查方法无显着性差异(P<0.05)。因比,Leifson染色法具有快速、敏感、可回顾性分析等优点,是一种非常有用的侵入性试验方法。

1.1.5 聚合链反应试验(PCR检测技术):利用与幽门螺杆菌功能基因分布有关的核酸片段设计PCR引物或探,依次进行体外基因扩增或杂交,过对该菌DNA测定而诊断有否感染幽门螺杆菌。目前幽门螺杆菌的多种基因,如尿素(A、B、C、D)基因,16S-rDNA基因,VacACagA基因均已克隆成功,根据幽门螺杆菌不同的耙基因,设计不同的引物,从而建立不同的PCR,用来检测幽门螺杆菌都取得了成功。用作PCR的胃粘膜标本应作匀浆处理和/或用特殊缓冲液溶解,以便获取足够的DNA。反应混合物中含有耐热DNA聚合酶、核苷酸、引物以及用来测定幽门螺杆菌DNA的胃粘膜标本。在PCR仪上经过30~40个扩增循环后,扩增产物可经凝胶电泳分析。如果在电泳中出现与引物相符的DNA,可判断为阳性。现在常用来识别幽门螺旋杆菌DNA的引物来自尿素酶基因(UreA)16S-rDNA基因。PCR目前主要是用作分子生物学及分子流行病学研究,尤其是用于菌株的DNA分型。幽门螺杆菌基因组DNA203bpPCR产物的单链构象多态(SSCP)也可用于分析和鉴定临床分离的幽门螺杆菌菌株。SSCP-PCR不仅可以用于大规模的幽门螺杆菌流行病学调查,而且能正确评估根除治疗后再现的幽门螺杆菌是复发还是再感染。该方法简单快速、敏感性强,易于比较。但PCR方法应用于胃活检组织诊断幽门螺杆菌感染,与细菌培养和组织学染色镜检比较无明显优越性。现在PCR可通过鼻胃管收集5ml胃液作PCR检测,敏感性96%,特异性100%(4)。采用胶囊包裹的尼龙线取胃液标本的方法,使这一诊断性试验的侵入性更小(5)。胃液PCR检测幽门螺杆菌敏感性高,但存在引物特异性问题,如针对尿素酶基因的引物,可能与口腔和胃内其它尿素酶阳性菌丛起交叉反应。

1.2  非侵入性检测方法
1.2.1  C13
C14尿素呼气试验(UBT)  幽门螺杆菌产生的尿素酶可将内源性或外源性尿素分解成NH3CO2,后者在小肠上段吸收,进入血后随呼气排出。口服一定量的C13C14尿素后,通过高灵敏度质谱仪或液闪仪分别测定呼气中C13C14的量可判断有无幽门螺杆菌感染。C13为稳定同位素,无放射性,但价格昂贵;C14为放射性同位素,辐射量较小,也有较高的安全性,其价格较廉,但孕妇及儿童仍不宜采
,且大规模使用可能给环境污染带来隐患。尿素呼气试验突出的优点是: (1) 无创、方法简便,不需要通过内镜获取标本;(2)克服了胃内幽门螺杆菌"灶性分布"及取材局限的缺点,能反映"全胃"情况,并可对胃内幽门螺杆菌的感染密度作半定量评估。尿素呼气试验有较高的敏感性和特异性,但仍受诸如药物、上消化道出血、胃内其它产生尿素酶细菌等因素影响,可能出现假阴性或假阳性。该法还受临界值高低的影响,因此临界值的确定非常重要;此外,也受服药至呼气收集间隔时间长短的影响,得到被检者的配合亦很重要,年幼儿童检测可能会有困难。呼气试验因仪器较贵,限制了它在基层医院的应用。但从临床条件出法,可作为根除治疗后一种复查方法;有人提出也适合于大规模流行病学调查,作者认为,见于C14的放射性及C13的昂贵费用,将呼气试验用于流行病学调查显然是不合适的。

1.2.2  15N尿氨排泄试验:口服含15N尿素后,利用15N尿素可被幽门螺杆菌产生的尿素酶分解产生NH3CO2, NH3经吸收在肝脏代谢而经尿中排出的原理,通过色质联用仪器检测尿中15N尿氨而判断有否幽门螺杆菌感染。该法无创、无放射性,敏感性和特异性高,但检测结果受机体吸收、代谢、排泄等众多因素干扰,且设备昂贵,临床应用受到一定限止。
1.2.3 
粪便幽门螺杆菌抗原检测:由于定居在胃上皮细胞表面的幽门
螺杆菌,随着胃粘膜上皮的快速更新脱落,幽门螺杆菌也随之脱落,并通过胃肠道从粪便排出。幽门螺杆菌粪便抗原检测试检采用酶联免疫分析双抗体夹心法,能够特异性诊断人体内幽门螺杆菌感染。资料显示该方法敏感性96.1%, 特异性98.5%(6)。该方法操简便、省时、不需昴贵仪器,适用于婴幼儿、儿童幽门螺杆菌感染的检测,幽门螺杆菌根治疗效评价,以及幽门螺杆菌感染的流行病学调查等(7,8)。粪便幽门螺杆菌抗原检测试检另一独特的优点,如尿素呼气试验在有胃部分切除手术史的患者中准确性有限,此试验则不受影响;尿素呼气试验需被检者配合,年幼儿童可能会有困难,而此试检仅需收集患儿粪便标本。现在,在美国有两家公司生产该试剂,其中一家就是我们Ameritek USA,产品称"HpAg";另一家公司的产品称"HpSA"。

1.2.4  血清及分泌物抗体检测:幽门螺杆菌菌体表面存在多种抗原成分,如尿素酶、脂多糖、粘附素等成分,这些抗原均可刺激宿主产生免疫反应,产生IgG、IgA、IgM抗体,传统的血清学检测主要是检测可长期存在于血清中的IgG抗体。常用的方法主要有酶联免疫吸附法、免疫酶试验、免疫印迹技术、胶乳凝集试检等。酶联免疫吸附法(ELISA)是目前最常选用的定性或定量的检测幽门螺杆菌抗体IgG的方法。但由于常选用活体细菌、福尔马林处理过的细菌、酸性甘氨酸抽取物等制备物作为抗原,与其它的细菌间可能发生交叉反应,影响检测结果。近年来应用纯化尿素酶作为抗原来检测抗体,提高了特异性;新型血清抗体的检测方法,如快速免疫色层法(Flexpact,TMHp)该法是根据反向免疫色层法原理,快速、定性测定血清Hp-IgG抗体,与组织学检查对照,其敏感性为94.68%,特异性为89.04%,符合度为92.22%(9);Hp快速检测试检(CIM test),它利用免疫层析技术检测全血、血浆或血清中的幽门螺杆菌特异抗体,该方法敏感性和特异性较高,只需采末稍血用试剂盒检测,15分便可得到结果。由于幽门螺杆菌感染数周后才出现特异性抗体,幽门螺杆菌阴性者血中也可存在交叉反应性抗体(如空肠弯曲菌),且幽门螺杆菌根除治疗后6~8个月内甚至几年可持续在阳性水平,故血清学阳性不能完全肯定患者有活动性感染,阴性也不能排除初期的感染。因此,血清学检测不宜作为现症感染或根除疗效评估的标准,主要用于易感人群的筛查及流行病学调查。CIM 试剂盒含有一个基于高度保守的重组抗原,故可以区分现症感染或既往感染。但该法在根除治疗6个月内仍不能很好的区分现症或既往感染,目前只可作为筛查初诊患者幽门螺杆菌感染的方法(10)。尿液、唾液等分泌物抗体检测方法,取样简便,无痛苦,其敏感性、特异性与血清学试验相似,结果也可受某些因素影响。
   
此外,侵入性诊断方法中的基因检测和非侵入性诊断方法中的基因芯片及蛋白芯片检测,都有较高的敏感性和特异性,但因这些方法技术要求较高,不易普及而多用于科学研究。
  上述侵入性和非侵入性检测方法主要针对胃幽门螺杆菌感染。C13C14尿素酶呼气试验、15N尿氨排泄试验,对口腔幽门螺杆菌感染的检测则成盲点,无法检出口腔中幽门螺杆菌的存在。由于口腔中菌群的复杂性及分布不均,可能影响从口腔中培养分离幽门螺杆菌。口腔标本的PCR检测是一种间接的方法,它的敏感性为84%,特异性为82.07%(11)。粪便幽门螺杆菌抗原检测、血清及分泌物抗体测定,既反映胃,也反映口腔幽门螺杆菌感染。目前尚无单独用于口腔幽门螺杆菌感染理想的检测方法。

 

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