1. 学习水样的采取方法和水样中细菌总数测定的方法

2了解水源水的平板菌落计数的原则

3.了解PCR技术监测污染水体大肠埃希菌的意义和基本原理

4．掌握PCR操作技术

实验材料：

1．培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

2．材料 水样

3．仪器及其他用具

恒温培养箱、三角烧瓶，带玻璃塞瓶，培养皿，移液器（1mL），移液管（1mL），试管等，PCR仪，水浴锅，培养箱，电泳仪，自动微量移液器（各型号），滤膜，PCR管，离心管，Whatman 3MM滤纸或相当产品。

4. 试剂及溶液

含有适当抗菌素的LB培养基，Taq DNA聚合酶，正向引物(20 mmol/L）及反向引物(20mmol/L）溶于水中，DNA分子量标准，乙酸铵（l0mol/L），无水乙醇，    TSEL (50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20%蔗糖，50mmol/L EDTA，1 mg/ml溶菌酶），    SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL蛋白酶K)，    TE缓冲液，l0×扩增缓冲液(500mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，15mmol/L，MgC1₂）。

    4种dNTP贮存液（20mmol/L，pH8.0 )，琼脂糖溶液(0.7%），电泳缓冲液(1×TAE)，溴化乙锭染色液，6×凝胶上样缓冲液。

实验原理：

本实验采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖。因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落计算得到的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基测定水中细菌总数。

大肠埃希菌（Escherichia coli )是指示粪便污染的重要指示物。当水体中出现大量的E. coli就说明近期内水体受到了粪便污染（因其脱离寄主后，其半存留期会大大缩短）。PCR检测这种微生物非常灵敏，即使每100mL水中只有一个个体，也能被检验出来。

实验内容：（一）细菌总数测定

自来水

(1)用灭菌移液管或移液器吸取lmL水样，注入灭菌培养皿中。

(2)分别倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。

(3)另取一空的灭菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。

(4)培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为lmL水样的细菌总数。

池水、河水或湖水等

(1)稀释水样：取3个灭菌空试管，分别加入9mL灭菌水。取lmL水样注入第一管9mL灭菌水内、摇匀，再自第一管取lmL至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10^-1，10^-2与10^-3。稀释倍数看水样污染程度而定，以培养后平板的菌落数在30~300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污染水样，取10^-1，10^-2,10^-3三个连续稀释度，污染严重的取10^-2，10^-3，10^-4三个连续稀释度。

(2)自最后三个稀释度的试管中各取1mL稀释水加入空的灭菌培养皿中。每一稀释度做两个培养皿。

(3)各倾注15mL己融化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

(4)凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h.。

菌落计数方法

(1)  先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。

(2)  选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。

(3)  若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。

(4)  若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

(5)  若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

(6)  若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。

（二）应用PCR技术监测污染水体大肠埃希菌

1．水样的处理及模板DNA的制备

(1)  取水样lmL，低速(2 000 r/min )离心5min，以除去不溶性杂质。取出上清，经6 000 r/min离心5min，收集菌体。

(2)  将菌体悬于100 mlTSEL溶液中，置37℃水浴作用30 min。

(3)  向反应混合物中加入300ml SSK溶液，置37℃继续作用60 min。

(4)  向反应混合物中加入2倍体积的无水乙醇，摇匀后置-20℃，2h. 12 000 r/min离心15 min，收集沉淀，室温晾干后将沉淀物溶于100~300ml无菌去离子水或TE缓冲液中备用。

如果是纯培养的菌落，即将菌落挑入100ml无菌去离子水中，加热煮沸1min，即可作为PCR模板。

2．引物设计

    本实验的引物来自E. coli的lac Z和lam B基因。

 lac Z引物1：ZL-1675（5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3'）

 引物2：ZR-2025（5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3'）

lam B引物1：BL-4910(5'-CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3'）

引物2：BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTATCACGCA-3'）

3．PCR扩增体系

    按以下次序，将各成分加在0.5mL PCR薄壁管内混合：

        l0×扩增缓冲液5ml

        20mmo1/L 4种dNTP混合液（pH8.0）1ml

        20mmo1/L正向引物2.5ml

        20mmo1/L反向引物2.5ml

        模板DNA 5~10ml

        Taq DNA聚合酶1~2单位

        补足H₂O至总体积50ml

4．PCR循环

按以下方法进行PCR扩增，典型的程序有变性、复性和聚合（延伸反应）。依扩增产物大小与引物碱基组成来确定时间与温度。时间与温度会影响到产物的特异性。具体参数需摸索。

5．扩增产物的检测和分析

 如果扩增产物大小与其他非特异性DNA片段相差很大，则可直接电泳，通过大小来判断；如果扩增产物中有特异性限制酶切位点，则酶切后电泳，由其大小来判断。

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