一、实验目的：

学习细胞固定化的原理，通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的枯草芽孢杆菌，掌握菌体包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。

二、 实验原理：

细胞固定化克服了传统游离细胞发酵的不足，本实验以海藻酸钠为载体，以CaCl2为交联剂，进行固定化枯草芽孢杆菌。海藻酸钠是从海藻提取获取的藻酸盐，为D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子（如Ca2+）可诱导凝胶。

三、 实验材料：

1.菌株：枯草芽孢杆菌。

2.发酵培养基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。

3.固定化用培养基：淀粉：2％；葡萄糖：0.5%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。

四、实验步骤：

（1）培养基灭菌：取250mL三角瓶，分别放入配好的液体培养基100ml，灭菌冷却。

（2）种子活化和接种：将枯草芽孢杆菌接入培养基，30℃培养活化，取活化后的枯草芽孢杆菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混匀。

（3）培养：将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min，25℃培养三天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次，制备菌悬液，使其中枯草芽孢杆菌菌数为2.3×107个/ml。

（4）海藻酸钠及交联剂的制备：

海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分别置于250ml三角瓶中，各加入100ml蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。

交联剂的制备：配制2%浓度的CaCl2，灭菌。

（5）固定化枯草芽孢杆菌的制备

将枯草芽孢杆菌细胞菌悬液与海藻酸钠溶液按照1∶1 充分混匀后,用一注射器,将混合液滴入交联剂中, 交联剂的阳离子从外部扩散进入海藻酸钠枯草芽孢杆菌混合液珠内, 将细胞包埋其中。制成凝胶小球，使酵母固定化，用无菌水洗涤固定化细胞，然后加入2% CaCl2，平衡24 h即可使用。

（6）固定化细胞的增殖：将固定化细胞转入固定化增殖培养基25℃，pH6下培养。

5 实验结果

   利用DNS法检测培养液中葡萄糖浓度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。

六、思考题

1、固定化细胞有何优点和缺点？

2、对细胞或者酶进行固定的方法还有哪些？

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