鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及进化树分析

吴翠娟^1,2，李福宝^1*李刚^2,3，张坤²，吴玉寒⁴，谢玉洁⁴

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036 ；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100093；3.动物营养学国家重点实验室，北京100093；4.合肥中大生物技术发展有限公司，安徽 合肥 230088）

摘要：从北京大兴区鸭场和安徽合肥肥西鸭场中分离感染菌株，通过对病鸭的临床症状和从病鸭及死鸭的剖检病变分析，疑似鸭疫里氏杆菌病例进行病料的细菌分离，并对分离的病菌进行形态培养、PCR检测、琼扩试验和外膜A蛋白的克隆，结果鉴定为鸭疫里氏杆菌，分别命名为BJY-2、BJYX-1和AH-1。并将测序结果与GenBank上公布的我国常见几种血清型相关序列进行比对，通过进化树分析结果发现BJY-2的外膜蛋白序列与FJ765034-RA2的最近；BJYX-1的外膜蛋白序列与FJ765033-RA1的相同；AH-1的外膜蛋白序列与5个血清型的较远。

关键词：鸭疫里氏杆菌；分离；克隆；进化树分析

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种急性或慢性传染病^[1]，主要侵害2～7周龄雏鸭，是现代养鸭业中造成小鸭严重死亡的主要传染病之一。我国郭玉璞等^[2]于1982年在北京首次发现此病,此后在全国各地等许多地区均有发生本病的报道。该病病原为鸭疫里氏杆菌,已报道有21种血清型^[3-4] , 各种血清型之间很少有交叉保护性^[5]。其中血清型1型、2型临床上最为常见, 且致病力最强。

外膜A蛋白 (OmpA)具有很强的免疫原性，它可以激发机体的体液免疫反应还可以引起细胞免疫，而且具有交叉保护作用^[6]。吴芳等^[7]用抑制性差减杂交(SSH)试验发现，OmpA基因还与RA毒力有关。本研究对分离出的3株RA的OmpA基因进行克隆和序列分析，旨在从系统进化角度探讨分离株与其它血清型之间的毒力关系。并为其临床诊断和分子鉴定提供一定的理论依据。

一 材料与方法

（一）发病情况

2008年10月，北京大兴相继几个鸭场2周龄雏鸭和成年鸭均有发病，且发病率高达10%。同期，安徽合肥肥西鸭场6周龄鸭发病，两个地区的病鸭发病状况相似，主要临床症状：精神萎靡，排黄白色或黄绿色稀便，咳嗽，从眼睛和鼻腔流出多量粘性或浆性分泌物，腹泻、头颈歪斜、不时甩头、有的脚肢麻痹、卧地不起，濒死期呈角弓反张。尸体剖检主要病理变化：鼻腔内积有粘液性分泌物；脑膜充血；心包内积有淡黄色纤维性渗出液，心包膜增厚；肝肿胀，表面覆盖一层淡灰色纤维素样膜；心包液混浊，心包表面有针尖大小的干酪样结节。  

（二）病料来源及分离菌的鉴定

1.病料来源

病鸭来自北京大兴区和安徽合肥地区自然发病鸭场，无菌采取濒死期鸭的心血、脑、肝组织。

2.培养性状观察

各组织分别接种于麦康凯培养基、鲜血琼脂平板和鸭疫里氏杆菌营养琼脂平板（简称RA板）。其中RA板置烛缸中培养，麦康凯和血平板常规培养均37℃ 24h～48h，观察细菌的生长情况、菌落特征及溶血情况等。

3.形态及染色特性

将分离菌株接种于RA板, 37 ℃烛缸法培养24 h后的培养物进行革兰氏和瑞氏染色, 光学显微镜下观察细菌的形态和染色特性。

4. PCR鉴定 

对疑似鸭疫里氏杆菌病例进行PCR检测，采用引物^[8]P1、P2可扩增809bp的DNA片段。引物序列为：P1：5’ACTCAAGGAAGAGCGGATCA 3’；P2：5’GCTTCAGCAGAACCAACTCC 3’，PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

（三）琼扩实验 

按文献^[9]方法：取大量接种于RA板培养物，悬浮于1ml的8.5% NaCl中，在沸水中煮沸5min，冷却后，4000r/min离心5min，上清液即为琼扩抗原。操作按常规方法进行，中间孔加抗原，外周孔加阳性、阴性血清。放入湿盒内37℃ 48h～72h，观察反应结果。

（四）基因克隆、测序及序列分析 

 阳性PCR产物采用DNA回收试剂盒回收目的片段，然后连接pGM-T载体，转化到TOP10感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性克隆，并送至上海生工生物工程公司测序。目的片段的回收、连接及转化均按文献^[10] 报道的方法进行。采用DNA Star软件对3菌株的OmpA基因序列与国内常见血清型菌株的相应序列进行分析比较，绘出系统进化树。

2 结果

（一）细菌的分离及培养特性

病料接种RA板，经37℃烛缸法培养24h～48h后，为光滑、微突起、透明、奶油状、直径为lmm～2.0 mm菌落。鲜血琼脂上长出乳白色、半透明、微凸起的圆形菌落。接种在麦康凯琼脂平板上均不生长。

（二） 形态及染色特性

细菌纯固体培养物经革兰氏染色结果为阴性、无芽孢的小杆菌，见稍长的丝状菌状；瑞氏染色呈两极浓染。

（三） PCR鉴定结果 

不同鸭场分离株进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析均出现809 bp大小的目的片段 。   

（四）琼扩试验结果

在阳性血清和抗原孔之间产生明显的特异性沉淀线，阴性血清与抗原无沉淀线。

（五） 菌株DNA序列分析

利用DNA Star对3株的OmpA核苷酸序列进行分析显示：BJYX-1与RA1型和RA2型株的同源性为100%，与RA3型、RA4型和RA5型株同源性均为99.9%，只有1个核苷酸差异；BJY-2与RA1型和RA2型株的同源性最高为99.8%，只有2个核苷酸差异，与RA3型、RA4型和RA5型株同源性均为99.6%；AH-1与RA1型和RA2型株的同源性最高为99.3%，与RA3型、RA4型和RA5型株同源性均为99.1%。但BJYX-1和BJY-2分离株与AH-1分离株的同源性分别为99.3%和99.0%，差异较大。比对证实该目的片段为RA的OmpA基因序列^见表1。

（六）系统进化树分析

BJYX-1株、BJY-2株和AH-1株和中国常见的5种血清型的进化树分析表明：BJY-2与FJ765034-RA2的OmpA序列最近，说明BJY-2 分离株与RA2型毒力和血清型靠近；BJYX-1与FJ765033-RA1的OmpA序列相同，说明BJYX-1 分离株与RA1型毒力和血清型靠近；AH-1与5个血清型代表序列较远。

3 讨论与小结

本实验对分离菌的培养特性和形态观察、PCR试验、琼扩试验，以及OmpA基因测序，确定2008年10月北京大兴区和安徽合肥肥西鸭场中流行的传染性疫病，均是由RA引起的鸭疫里氏杆菌病。通过测序结果和GenBank上公布的我国常见5种血清型的OmpA比对分析，BJYX-1与RA1型和RA2型株的同源性均为100%，但进化树显示与RA2近； BJY-2与RA1型和RA2型株的同源性均为99.8%，与RA1近；AH-1与RA1型和RA2型株的同源性均为99.3%。但北京大兴的BJYX-1和BJY-2分离株与安徽合肥肥西AH-1分离株的同源性差异很大，也许是属于这5型之外的其他血清型；这和RA复杂的血清型的相关报道是一致的。

外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，具有免疫原性且能诱导保护性免疫反应^[11]。吴芳等^[7]通过抑制性差减杂交试验发现外膜蛋白为RA可能的毒力基因，但没有发现明确区分RA毒力和非毒力菌株的标志基因。近年来，用于预防鸭疫里氏杆菌感染的疫苗，虽有灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗等, 但由于RA 的多血清型，且菌苗所诱导的免疫力具有血清型特异性，所以效果不佳。因此理想的菌苗应含有主要血清型菌株，以提供有效的保护。周祖涛等^[11]通过对OmpA的研究来说明OmpA是RA最主要的外膜蛋白，而且各血清型的OmpA蛋白同源性较高，因此可以用OmpA基因的表达产物建立ELISA方法检测RA所有的血清型。

当前鸭疫里氏杆菌感染呈全球性流行, 是造成养鸭业经济损失的最主要传染病之一, 其血清型之多、地域分布之广、加之用药治疗易产生耐药性, 使得对该病的防制工作相当繁重^[12]。因此建议预防此病（1）加强饲养管理和场区环境卫生，定期进行场地消毒，杜绝或减少各种应急因素的产生。（2）对于鸭疫里氏杆菌发病严重地区,建议在饲料中定期按疗程添加一些敏感药物进行预防，但注意不能滥用，以防鸭产品的药物残留，而影响其产品对人的安全性。

参考文献：（略）