超声破碎的条件一般是300w,10s/10s,20分钟,具体条件可根据自身情况而定。
超声前菌体的准备:菌液离心后,先用PBS将菌沉淀洗2-3遍,然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体,裂解液的成分:50mMTris-HCl, pH8.0,
如何判断是否超声完全:根据网友的经验,一般有以下几个方面:
1, 外观判断:超声前菌悬液是浑浊的,超声完全后变的透明、清澈。
2, 液体的粘滞性:超声后菌液从枪头滴下不粘连。
3,高速离心:有用高速离心检测超声破碎程度的(一般用
4,染色:破碎后的菌液涂片,革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟,镜检。
超声后加入核酸酶消除核酸对蛋白的污染。
一些需要注意的问题:
1,蛋白以包涵体形式表达,追求的是高破碎率,要求细胞碎片很小,而另一种蛋白是可溶形式表达,所以细胞碎片不能很小,两种情况要求不同但目的相同,都是便于后期的固液分离。
2,如果超声时出现黑色沉淀,说明超声功率太强。
3,超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
4,尽量防止泡沫的产生。
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