按照上表配成100倍母液8种，各配成1L，各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中

MS培养基中还需要加入萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母液（1 mg/mL）。其配制方法是：分别称取这2种物质各100mg， NAA用少量乙醇溶解，6-BA用少量的NaOH溶液，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得1mg/mL的母液。

1当量氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，加蒸馏水定容到100mL。

1当量盐酸：量取浓盐酸9mL，加蒸馏水定容到100mL。

用量筒或移液管从各种母液中分别取出10ml, 与各种母液一起放入烧杯中。然后量取所需浓度的NAA或6-BA加入烧杯中，称取蔗糖30g,加入烧杯后，定溶到1L。

调pH值  用酸度计或PH试纸测溶液PH值（可用1当量的氢氧化钠和1当量的盐酸调节PH值直到培养基的pH为5.8为止），培养基的pH必须严格控制在5.8。

称取5g左右琼脂粉倒入烧杯中，然后在电炉上加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

培养基的分装  溶化的培养基应该趁热分装。将烧杯中的培养基倒入培养瓶中，注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。每1L培养基，可分装25～30瓶。

培养基分装完毕后，用硫酸纸或封口膜及时封盖瓶口。如果组培瓶有盖则盖上盖子。

增殖培养基：MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L

生根培养基：MS+ NAA0.2+蔗糖30g/L+琼脂粉 5g/L

培养基配方是在不断实践摸索中，才能找到最适合的培养基。

 

将分装好的培养基放入高压蒸气灭菌锅灭菌
    培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
    注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
    关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。

到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气压入，内外压力平衡，盖子便易打开了

灭好菌后，让培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用

植物材料表面用消毒剂灭菌
    从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体（explant)。
    首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
    洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。
    第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
    第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1-2种使用见下表。

常用灭菌剂使用浓度及效果比较表

灭菌剂名称	使用浓度%	消毒难易	灭菌时间	灭菌效果
氯化汞	0.1-0.2	较难	2-10	最好
漂白粉	饱和溶液	易	5-30	很好
次氯酸钠	2（活性氧）	易	5-30	很好
过氧化氢	10-12	最易	5-15	好

    上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8-10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒。
    灭菌时，不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，氢净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
    在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
    最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要求3分钟左右，视采用的消毒液种类，漂洗3-10次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

接种在超净台上操作，接种前超净台上和接种间的紫外线灯开30分钟以上杀菌。

在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

 

 

接种步骤

1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。