一 实验目的

  1、掌握厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。

   2、观察双歧杆菌的形态特征并了解双歧杆菌的生长特性。

   3、了解双歧杆菌鉴定的一般方法。

二 基本原理

    厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

    双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。

    双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术 。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。

目前，双歧杆菌鉴定的方法有很多种。近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。

三 实验用具

    高纯氮气   厌氧管  注射器  培养箱   冰块  水浴锅   镊子  记号笔  MRS培养基   细菌生化微量鉴定管  酒精棉球  瓷盘   振荡器  铜柱除氧系统  定量加样器  恒温水浴  载玻片  显微镜  恒温培养箱  超声波破碎仪  滤纸  层析缸  酒精灯  封口膜  厌氧罐  等。

四、实验方法与步骤

    1 铜柱系统除氧

    铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N₂、CO₂ 和H₂等都含有微量O₂，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O₂化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H₂时，H₂与CuO中的氧就结合形成H₂O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H₂源也可以由氢气发生器产生。

    2 预还原培养基及稀释液的制备

    制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N₂气的长针头以排除O₂。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。

    3 分离

    （1）编号

    取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10^-1、10^-2……10^-5。

    （2）稀释

    在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10^-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10^-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10^-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10^-7，制成不同样品稀释液。通常选10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度进行滚管计数。

    （3）滚管分离

      a、滚管

    将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，用无菌注射器吸取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

      b、分离

    生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养。培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

    4 计数并镜检

    （1）计数

    液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量。公式如下：

双歧杆菌数量cfu/g（mL）样品=0.1mL滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数

    （2）镜检

     挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。

    5 菌种鉴定

    ⑴ 双歧杆菌特定酶的检测

    利用果糖-6-磷酸盐对分离得到的菌种进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）的测定，初步确定菌种是否为双歧杆菌属。F6PPK测定的操作如下：

    ① 将从样品中分离出的双歧杆菌培养于厌氧液体改良MRS培养基中37℃生长24 h。

    ② 将菌液4400 rpm离心10 min,收集菌体，缓冲液ⅰ洗涤2次，最后溶于约4 mL缓冲液ⅰ中，制成细菌悬液。

    缓冲液

    ⅰ 现用现配。取0.05 M Na₂HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH₂PO₄ 68.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐。

    ③ 用超声波粉碎仪，400 W条件下；每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min，至菌体溶液呈半透明。

    ④ 破碎后，取0.5 mL 于离心管中，加试剂ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保温30 min。

    ⅱ 6 mg/mL氟化钠加10 mg/mL 碘乙酸钠。

    ⅲ 果糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液。

    ⑤ 加试剂ⅳ 0.750mL, 室温10 min。

    ⅳ 现用现配。盐酸羟胺139 mg/mL。酸性极强，用氢氧化钠中和至pH6.5。

    ⑥ 加试剂ⅴ和ⅵ各500 µL, 室温5 min。

   ⅴ 三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。

   ⅵ 4 M HCl。

    ⑦ 加试剂ⅶ 500 µL, 显色。红褐色或红紫色为阳性，黄色为阴性。

    ⅶ 0.5 g/100 mL FeCl₃·6H₂O溶于0.1 M HCl。

    ⑵ 乙酸、乳酸等有机酸的测定——纸层析法

    ① 层析滤纸的制备——将层析滤纸剪成1.5cm*11cm的长条状，在距层析纸一端约4cm处用铅笔划线确定点阳线，使用前充分干燥。

    ② 配制展开剂——正丁醇:甲酸:水=80:15:5

    ③ 配制标准液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液

    ④ 制备待测样品——将菌种37℃ 培养24h后离心，收集上清液

    ⑤ 点样——用毛细管分别吸取发酵液，多次点样于滤纸条上，样点直径不宜超过2mm，平衡2h

    ⑥ 层析——将点好样的层析纸放入，使点有样品的一端浸在展开剂中，但不可浸及样点。观察展开情况，待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5cm处，取出层析纸。

    ⑦ 显色——以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂，待层析液挥发之后，向层析滤纸喷洒并计算Rf值。

注释：物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R_f值 (比移值 R_f value 又称R_f值) 来表示：

    R_f = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离

    在一定的条件下某种物质的R_f值是常数。R_f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关，是一个定性分析的重要参数。

    ⑶糖发酵试验

    糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

本实采用现成的细菌生化微量鉴定管 ，鉴定管的种类如下：

    乳糖    麦芽糖      甘露糖   甘露醇    蔗糖    阿拉伯糖 D-核糖   木糖（木胶糖）  半乳糖   松三糖  山梨糖    淀粉   水杨素    葡萄糖酸盐       草糖（海藻糖）  血清菊糖   棉子糖    果糖   蜜二糖   纤维二糖

    具体实验步骤：

    ① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

    ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

    ③ 24h后观察各管中液体变颜色情况，若变色则为阳性，反之阴性，对照凌代文编著的《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》“鉴别双歧杆菌属内种的特征”表即可初步确定其种别。

五 注意事项

    1 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。

    2 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。

    3 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。

六 实验结果记录

（下列表格供参考）

表一  双歧杆菌培养过程中菌落计数

表二  双歧杆菌菌株属的鉴定指标与鉴定结果

表三 双歧杆菌菌株糖醇发酵试验结果

     　          注：表中+表示待测菌株阳性，-表示待测菌株阴性

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