接种后的外植体应转移到培养室进行培养，培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。培养室控制的条件主要有温度、光照、湿度和气体。

温度是植物组织培养中的重要因素，在适宜的温度下植物才能良好的生长、分化。多数植物适宜生长温度是在20~30℃，低于15℃时生长停止，高于35℃会抑制正常生长和发育。一个培养室内往往培养着许多种植物，为适合大多数植物生长，培养室的温度一般设定在（25±2）℃。

植物在自然界中长期进化的结果，不同的植物对环境温度的要求各异。一般生长在高寒地区的植物，其最适生长温度较低；而生长在热带地区的植物，则对环境温度相对要求较高。如马铃薯在20℃情况下培养效果较好，菠萝在28-30℃情况下培养效果较好。在条件允许的情况下，可设立多个小培养室，根据不同植物对环境温度的要求来设定培养室温度。同时，也可根据培养室内上下层架的温差来调节，一般培养室内最上层与最下层的温差为2-3℃。

光是植物进行光合作用必不可少的条件之一，对离体培养物的生长发育具有重要的作用。光照的影响主要表现在光照强度、光照时间和光质3个方面。

    对多数植物来说，1000~4000lx的光强即能满足其生长的需要。器官的分化需要光照，并随着试管苗的生长，光照强度需要不断地加强，才能使小苗生长健壮，并促进它从“异养”向“自养”转化，以提高移植后的成活率。通常在初代培养和继代培养阶段，1000~2500lx即可满足要求。而对于生根壮苗阶段，宜提高到3000~3500lx甚至10000lx。光照强度强，幼苗生长得粗壮，而光照强度弱，幼苗容易徒长。

对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。另外，在有些植物组织培养中，光的存在有时会抑制根的形成，这是可以在培养基中加入活性炭，提高根的形成率。

普通培养室要求每日光照12~16h。生产中，在不影响材料正常生长的条件下，尽量缩短光照时间，减少能源消耗，降低生产成本。在进行葡萄茎段培养时，对日照敏感的品种只有在短日照条件下才能形成根，而对日照长度不敏感的品种在任何条件下培养均可以形成根。

光质对细胞分裂和器官分化也有很大影响。如在香石竹的培养中，蓝光有利于诱导侧芽产生，还有利于蛋白质含量的增加；红光可以促进芽增长，并且生长整齐。白光有利于试管苗的生长发育，生物产量最高；红光次之；蓝光促进提高茎叶中的还原糖含量，但对总糖的影响不大；白光还能增大叶绿素的合成。在唐菖蒲的子球切块培养中，在蓝光下出苗比在白光和红光下早，且幼苗生长旺盛，根系粗壮；白光下幼苗纤细；红光下出苗量少。而红光对百合和四季豆愈伤组织的诱导和生长比在白光下好。光质对植物组织分化的影响，目前尚无一定规律可循，这可能是不同植物对光信号反应不同所致。但如果能把这些光质的作用，有意识地运用到种苗的规模化生产中，可达到节省能源，提高产量的目的。

组织培养中的湿度影响主要有培养容器内湿度和培养环境湿度两方面。

容器内的湿度可保持在100%，之后随着培养时间的推移，相对湿度也会有所下降。容器内的湿度主要受琼脂含量和封口材料的影响，在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，不利于外植物体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。在培养容器封口材料选择上应十分注意，所选择的封口材料至少要保证在一个月内有充足水分来满足外植体的需要。如果培养容器内水分散失过多，培养基渗透压升高，会阻碍培养物的生长和分化。当然，封口材料过于密闭，影响气体交流，导致有害气体难于散去，也会影响培养物的生长和分化。

环境湿度变化随季节和大气而有很大变动。湿度过高或过低对培养材料的生长都是不利的，过低会造成培养基失去而干枯，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋生，导致大量污染。培养室的相对湿度一般要保持在70%~80%，湿度过高时可用除湿机降湿，过低时可采用喷水或拖地来增湿。