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几种因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响研究



录入时间:2010-9-30 9:09:16 来源:互联网

 

几种因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响研究

摘要:通过利用λ噬菌体对大肠杆菌烈性侵染特性,研究了宿主生理状态、pH、宿主数量、金属离子及表面活性剂等外界因素对侵染过程的影响,结果表明:宿主生理状态最为重要,指数分裂期的宿主细胞最易受到侵染;pH68的中性条件下有利于噬菌体吸附增殖; 100mg/L钙、镁离子能够促进吸附侵染过程;100mg/L铁离子和0.2%吐温80能够抑制吸附侵染过程。

关键词:噬菌体; 大肠杆菌 ; 宿主;侵染

噬菌体Bacteriophage)是一类专性寄生的原核生物病毒,分布广泛于土壤、空气、水中或生物体内。根据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体(virulent phage)和温和噬菌体(temperate phage)两大类[1]。噬菌体对发酵工业危害巨大[ 2-4],本文以λ噬菌体为模式病毒,研究几种外界因素对噬菌体侵染宿主规律的影响。

1  材料和方法

1.1.   材料

1.1.1  菌种: E.colik12Sgal-(简称负菌)、E.colik12F2gal-/λgal+(简称正菌)

1.1.2 培养基及缓冲溶液

液体肉汤培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%,pH7.2

上层半固体培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%,琼脂0.6 %,pH7.2

下层固体培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%,琼脂1.8%,pH7.2

加镁磷酸缓冲液:KH2PO4 2g ,K2HPO4 7g ,MgSO4.7H2O 0.25g ,蒸馏水1000mL

1.2.   方法

1.2.1  λ噬菌体裂解液的制备[5]

     液体肉汤培养基将正菌活化18h,离心收集菌体,缓冲液洗涤,紫外线照射10s15s,黑暗培养3h,加入0.4mL氯仿剧烈振荡30s60s,静止5min。离心(4000r/min15min,上清液分别移入试管中,此液即为λ噬菌体裂解液。再次侵染负菌得到噬菌体富集液。

_________________

1.2.2噬菌体效价的测定

采用双层平板法,将下层固体培养基倒平板凝固为底层平板,液体肉汤培养液将噬菌体裂解液10倍稀释至10-7,5mL融化的上层半固体培养基冷却至45℃左右,分别加入0.5mL负菌敏感菌液,同时加入0.2mL不同稀释度的噬菌体裂解液,迅速倾于底层平板上,轻轻摇匀,待凝固后,置37℃培养24h。统计平板上形成的噬菌斑数量,并计算其效价(噬菌体个数/ml)。

2 结果与分析

正菌菌株是整合λ噬菌体的溶源性大肠杆菌,负菌菌株的λ噬菌体整合能力缺失,因此正菌菌株经紫外线诱导后裂解的λ噬菌体,对负菌菌株则表现为烈性噬菌体的侵染效果。

2.1 紫外诱导大肠杆菌正菌裂解噬菌体的效价

经紫外诱变,正菌被裂解形成的噬菌体裂解液效价为: 2.743×107/mL

经负菌扩增得到的噬菌体富集液的效价为:1.097×109 /mL 

2.2大肠杆菌的生理状态对噬菌体侵染的影响

噬菌体在固体平板上侵染宿主能够形成基本固定大小的噬菌斑,一般12h左右噬菌斑直径大小不再扩展,说明噬菌体对宿主的侵染是有限制的,这种限制是否与大肠杆菌的生理状态有关?将大肠杆菌负菌接种于液体肉汤培养基中,并等分到8个三角瓶中,37℃摇瓶培养,并每隔2h,取出一瓶接入稀释的噬菌体,,同时无菌培养基接入噬菌体为对照,继续培养到30h,分别稀释后双层平板法观察噬菌体数量,结果见表1。

 以对照的噬菌斑结果为阴性结果,则表1显示出前12h噬菌体能够良好侵染宿主,而这个时期正是宿主的快速分裂期,12h后宿主进入稳定期,侵染力也随之丧失,充分说明了噬菌体对宿主的侵染与宿主的生理状态有关,这与固体平板上噬菌斑长到一定大小时不在扩展的结果是一致的。

接入时间/h

2

4

6

8

10

12

14

16

平板上噬菌斑的情况

+++++

+++++

+++

+++

+++

+++

-

-

1  生理状态对噬菌体侵染的影响

注:+++代表噬菌斑数大于300,

2.2 pH对噬菌体侵染的影响

配制不同pH的上层半固体肉汤培养基, 45℃水浴保温,分别加入0.5mL的敏感菌液,同时加入0.2mL的噬菌体稀释裂解液,摇匀后,双层平板观察噬菌斑生长情况。

2 pH对噬菌体侵染的影响

pH

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

噬菌斑生长情况

-

++

+++

++

-

注:+++代表噬菌斑数大于300  ++代表噬菌斑数大于200  代表无噬菌斑生成

3结果表明pH6.08.0时,大肠杆菌生长良好,同时也适合λ噬菌体的侵染。

2.3 敏感菌的数量对噬菌体侵染造成的影响

6支已灭好菌的半固体肉汤培养基,分别加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL的敏感菌液,同时迅速加入稀释0.2mL的噬菌体裂解液,摇匀迅速倾于底层为肉汤固体培养基平板上,轻轻摇匀,待凝固后,置37℃培养24h。

3  敏感菌的数量对噬菌体侵染的影响

敏感菌/ml

0.1

0.2

0.5

1.0

1.5

2.0

噬菌斑

+++

+++

+++

+++

+++

+++

注:+++代表噬菌斑数大于300

由表3可知,不同量的敏感菌液对噬菌斑数量没有明显影响。

2.4 金属离子浓度对噬菌体侵染造成的影

在上层半固体培养基中分别加入不同浓度的不同金属离子,再接入稀释的噬菌体和宿主,观察噬菌斑数量,以无离子为对照。

4  金属离子浓度对噬菌体侵染的影响

金属离子的浓度

对照

Ca2+

K+

Mg2+

Fe2+

Mn2+

Cu2+

Zn2+

0

++

 

 

 

 

 

 

 

50(mg/L)

 

++

++

++

++

++

++

++

100(mg/L)

 

+++

++

+++

+

++

++

++

注:+代表噬菌斑数小于200  ++代表噬菌斑数大于200  +++代表噬菌斑数大于300

由表4可知,100mg/LCa2+ 、Mg2+能够促进噬菌斑的生成,而100mg/LFe2+则减少了噬菌斑生成,表明Ca2+ 、Mg2能够促进噬菌体对宿主的吸附,而Fe2+则抑制噬菌体对宿主的吸附,而其他的金属离子K+、Mn2+、Cu2+、Zn2+等则对噬菌体吸附没有明显的作用。

2.5  表面活性剂(吐温80)对噬菌体侵染造成的影响

半固体肉汤培养基中,加入0.2%的吐温80,同时加敏感菌液和噬菌体裂解稀释液,摇匀并迅速倾于底层培养基平板上,轻轻摇匀,待凝固后,置37℃培养24h,观察噬菌斑生长情况。

表 活性剂(吐温80)对噬菌体侵染的影响

活性剂(吐温80

加入

不加

噬菌斑生长状况

+

++

注:+代表噬菌斑数小于200  ++代表噬菌斑数大于200

由表5可知,加入吐温80后,噬菌斑减少,由于吐温80是表面活性剂,因此主要作用应该是减少了噬菌体对细菌细胞膜的吸附作用。

3  

平板培养基上的噬菌斑长到一定程度,就不再继续扩大,表明噬菌体对敏感菌株的侵染受到了一定的限制。研究了宿主的生理状态、环境pH、敏感菌数量、金属离子浓度、表面活性剂等因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响,得出结论如下:(1)噬菌体侵染宿主时,宿主的生理状态最为重要,处于指数分裂期的大肠杆菌更易被噬菌体侵染;(2)在pH68的中性条件下有利于噬菌体吸附增殖,而在过酸和过碱的情况下不易增殖;(3)一定条件下,敏感菌的数量对噬菌体的侵染影响不大;(4)较高浓度(100mg/L)的Ca2+、Mg2+对噬菌体的吸附增殖有促进作用;而同浓度的Fe2+对噬菌体的吸附增殖有阻碍作用,(50.2%表面活化剂吐温80可以破坏敏感菌的细胞膜,从而影响了噬菌体的吸附增殖。 该结论可能为降低发酵工业中噬菌体感染提供了一定的思路。

 参考文献:

[1] 周德庆.微生物学教程[M],北京:高等教育出版社,2002:63-81

[2] 钟继才.危害乳业的噬菌体的预防对策[J] .中国乳品工业,2006, 34( 7):61-62

[3] 陈树勋,吴建梅.红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育[J].现代食品与药品杂志,2006, 16(2):83-85

[4] 刘琼, 赖滨霞,廖付荣.卡那霉素抗噬菌体生产菌株的选育及应用[J] .福建畜牧兽医 2004, 26(2):3-4

[5] 杜连祥.工业微生物学学实验技术[M],天津:天津科学技术出版社,1992:207-209

 

 

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