猕猴桃细菌性溃疡病菌的分离鉴定方法

1、病原鉴定

根据叶片上的水渍状晕圈和枝干上白色水滴状菌脓初步诊断为细菌性病害。取病健交界处组织一块，放于载玻片上，向小块上滴1–2滴无菌水或蒸馏水，加盖玻片后。立即用低倍显微镜观察水滴与组织交界处，见到云雾状菌溢，亦可证明组织内有细菌存在。

2、病原分离

新鲜病健交界处的病组织洗净后切成4 mm×4 mm小块，用灭菌水冲洗3次；分别用70％酒精和0.5％–1％的次氯酸钠进行表面消毒，病组织在消毒液中浸泡1–2 min，再用无菌水冲洗3次，按下列方法进行分离。

培养皿稀释分离法：取灭菌后的培养皿3–4个，每皿加灭菌水0.5 m1，将经表面消毒并充分冲洗的病组织小块移至第一皿的水滴中，用灭菌玻璃棒碾碎，静置30分钟左右，是组织内细菌流入水中，配成悬浮液。用灭菌后的接种环从第一皿内移植2–3环至第二皿内并充分、混合后再移植到第三皿，依次稀释到最后一皿。将熔化的琼脂培养基冷却至45 ℃左右，倒入每个皿中，在培养基未凝固前，轻转动培养皿，使培养基与菌悬液混匀，冷却后将培养皿翻转，置25–30 ℃下培养。

平板划线培养法：将上述的病组织放在灭菌载玻片上的一滴灭菌水中，玻棒搅碎，静置一段时间，用灭菌的接种环在普通培养基或选择性培养基上划线培养。

培养基可选用：

肉汁胨琼脂培养基（BPA）：

        牛肉浸膏                3.0 g

        蛋白胨                  5–10 g

        蔗糖                    10.0 g

        酵母膏                  1.0 g

        琼脂                    17.0 g

        蒸馏水                  1000 ml

        pH                      7.0

培养性状：菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑，生长缓慢，直径约1–3 mm。

蔗糖蛋白胨培养基（SPA）：

        蔗糖                    3.0 g

        蛋白胨                  5.0 g

        K₂HPO₄                   0.5 g

        MgSO₄•7H₂O               0.25 g

        琼脂                    17.0 g

        蒸馏水                  1000 ml

        pH                      7.2–7.4

培养性状：菌落呈粘稠状。

金氏B培养基（KBA）：

        甘油                            10.0 g

        膘蛋白胨（proteose peptone）      20.0 g

        K₂HPO₄                           1.5 g

        MgSO₄•7H₂O                       1.5 g

        琼脂（水洗）                    17.0 g

        蒸馏水                          1000 ml

        pH                              7.2

培养性状：有黄绿色荧光。

3、致病性测定

应选择未成熟的及正在迅速生长的植物的新梢、新叶进行；尽可能模拟自然侵染方式接种寄主。

将培养24–72 h的单胞菌落制成菌悬液，浓度为3×10⁸ CFU/ml，进一步稀释到10⁴–10⁷ CFU/ml，用针刺法或涂抺伤口法对猕猴桃离体枝叶或幼苗、新枝等进行接种，温度为15 ℃左右，保湿48 h，7–10 d后观察，如表现明显症状，证明所分离的单胞菌落为植物寄生细菌，可进一步做细菌学和生理生化性状的观察试验，以鉴定细菌的种类。

如分离所得菌株过多，可采取烟草过敏反应（HR）以快速测定分离物的致病性。方法是配制10⁷–10⁸ CFU/ml的菌悬液，用注射针将菌液从烟草下表皮注入叶肉组织间。烟草植株应保持在25 ℃，相对湿度85%，日照16 h条件下，在24–48 h表现枯斑的为阳性反应，3 d后出现黄斑的为阴性反应。

HR测定是LOPAT试验的测定项目之一，对于荧光假单胞菌的鉴定很有意义。猕猴桃细菌性溃疡病的HR为阳性。

4、形态特征观察

细菌的形态和大小的观察：用接种环从固体培养基表面挑取少量细菌和蒸馏水混合，配成细菌悬浮液，取一滴悬浮液均匀地涂于干净的载玻片上，任其自然干燥，通过火焰2–3次固定后染色，所用菌种龄应在24–48 h，可用苯酚品红染色法染色。

革兰氏染色的菌体通常也可同时进行细菌菌体形态、大小及排列情况的观察。

革兰氏染色法：猕猴桃细菌性溃疡病菌为革兰氏阴性。可用结晶紫草酸铵染色法进行。另外，用KOH溶解试验可作为辅助试验，快速确定细菌的革兰氏属性。方法如下：取1–2滴3 % KOH溶液置于干净载玻片上，用接种环或牙签将培养24–48 h的单个或少许几个菌落移到KOH液滴中，搅动5–15 s后，用接种环或牙签将菌液向上提取，观察提取时有无粘丝现象出现。凡是革兰氏阴性菌提取时都有清楚的粘丝相连，且KOH液滴变稠。

鞭毛染色观察：可用西萨–基尔染色方法。

猕猴桃细菌性溃疡病菌为极生单鞭毛，少有2–3根。

荚膜染色法：猕猴桃细菌性溃疡病菌无荚膜。

芽孢染色法：猕猴桃细菌性溃疡病菌无芽孢。

经过以上症状观察、病原菌分离、培养性观察、致病性测定及形态特征观察、即可基本完成病原菌的鉴定。

猕猴桃细菌性溃疡病菌Pseudomonas  syringae  pv. actinidiae的主要特征

菌体短杆状，大小为（1.4–2.3）μm×（0.4–0.5）μm，革兰氏染色阴性，无荚膜，不产芽孢；鞭毛单极生1–3根。

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