猕猴桃细菌性溃疡病菌检疫技术操作办法

1  主题内容及应检范围

1.1  本办法规定了猕猴桃细菌性溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al. 的检疫检验及检疫处理操作办法。

1.2  本办法适用于林业植物检疫机构对猕猴桃属Actinidia spp.植物活体、残体的检疫检验和检疫处理。

2  产地检疫

2.1  种苗繁育基地的建立

2.1.1  培育的猕猴桃，应从无病区采集接穗，或用无病虫的当年生半木质枝条作插条。

2.1.2  加强晚秋水、肥管理，避免在强风和冬季低温的高海拔区，即易发生霜冻的地方建园。

2.2  踏查

2.2.1  在种苗繁育基地、猕猴桃栽植地的果园、林场，以自然界线、道路等为单位进行线路（目测）踏查。

2.2.2  调查寄主的主干及分枝上部是否有淡黄色或黄褐色病斑；病斑处是否有小孔，从中向外流出白色或铁锈色液体，病部下方形成深褐色污斑。

2.2.3  调查枝条上是否有暗绿色或暗褐色水渍状纵向、线形龟裂；新梢是否呈暗褐色萎蔫枯死，病部浸出白色水渍状液体。

2.2.4  调查叶片上是否有红色小点，或大小为2–3 mm的褐色多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈，叶片向里或向外翻卷。

2.2.5  确认有疫情需进一步掌握危害情况的，需设标准地（或样方）做详细调查。

2.3  标准地（或样方）调查

2.3.1  种苗繁育基地样方设置与调查

2.3.1.1  样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。

2.3.1.2  每块样方面积为0.1 hm²，采取棋盘式取样法，抽取样树5–10株，进行病害分级调查。

2.3.2.  果园标准地设置与调查

2.3.2.1  按果园面积设置，10 hm²以下（含10 hm²）设1块，每增加5 hm²增设1块。

2.3.2.2  每块标准地面积为0.1 hm²，采取棋盘式取样法，抽取样树10株，进行病害分级调查。

2.4  病害分级标准

单株病害分级标准

Ⅰ级  全株叶、蔓无病                                      代表值0；

Ⅱ级  1–20片叶和1个侧蔓发病，或1/3以下的新梢发病       代表值1；

Ⅲ级  21–30片叶和2–3个侧蔓发病，或1/3–1/2的新梢发病   代表值2；

Ⅳ级  31片以上叶和1–2个主蔓发病，或1/2以上新梢发病     代表值3；

Ⅴ级  主干发病1/3，或多数侧蔓发病、植株部分枯死           代表值4；

Ⅵ级  主干发病1/3，或全部主蔓枯死发病、全株枯死           代表值5。

果园病害分级标准（以被害株率为标准）

轻  被害株率 10%以下；  

中  被害株率 11%–30%；

重  被害株率 31%以上。

2.5  所采集的感病材料应包含植物的所有部分和各种症状部分。应尽可能采集感病初期的病株部分，以利于病原细菌的分离。

2.6  样品置于聚乙烯袋内或其它合适容器内保鲜和防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。

3  调运检疫

3.1  抽样比例 

3.1.1  苗木100株以内（含100株）的应全部检查；100–1000株按10 %抽取；1000株以上按一批货物总件数（株）的5 %抽取。

3.1.2  植株及植株残体应全部进行检查。

3.2  抽样方法

3.2.1  苗木按照抽样比例，采取分层方式设5个样点进行抽样。

3.2.2  对携带有病症的植株及植株残体应全部进行检查。

3.3  现场检验

3.3.1  检查寄主的叶片是否向里或向外翻卷，并有红色小点或多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈。

3.3.2  检查1–2 a枝条上是否有水渍状纵向、线形龟裂，新梢是否萎蔫枯死，并有白色水渍状液体溢出。

3.3.3  检查寄主干部是否在病斑下方呈深褐色并有铁锈色液体溢出。

4  检疫检验

4.1  溢菌检验  在具典型症状的病部上，取病健交界处的一小块病组织，在显微镜下切片检查是否有大量细菌液溢出。

4.2  分离培养检验

4.2.1  取小块病斑组织，经表面消毒，灭菌水洗3次后，研碎静置10 min，采用假单孢属选择性培养基进行分离，将分离并经纯化后的细菌移植到BPA培养基斜面上培养48 h，置8 ℃冰箱保存。分离鉴定方法见附录1。

4.2.2  检查在BPA培养基平板上是否形成污白色、圆形、全缘、凸起、光滑、直径约为1–3 mm的菌落；在KBA培养基上未见荧光；在Luisetti培养基上发生蓝色荧光及在SPA培养基上呈粘液状菌落。

4.3  染色检验

4.3.1  鞭毛染色  采用西萨—基尔染色法。经染媒5–7 min→水洗干燥→苯酚品红染色5 min→水洗干燥后镜检。

    显微镜下菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，极生1–3根。

4.3.2  革兰氏染色  采用结晶紫草酸胺染色法。经固定涂片→染色1 min→水洗数秒吸干→碘液处理1 min→水洗数秒吸干→褪色30 s→水洗数秒吸干→复染10 min→水洗吸干后镜检。

    显微镜下菌体为革兰氏阴性反应，呈红色。

4.4  生理生化检验

4.4.1  生长与温度试验  菌株生长最高温度为35 ℃；最适生长温度为25–28 ℃；致死温度为55 ℃条件下10 min。

4.4.2  精氨酸双水解酶检验  配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌®冷却®针刺接种细菌至培养基底部®立即用灭菌凡士林封管→在27℃条件下培养7 d。

    在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。

4.4.3  果聚糖（Levan）试验  用细菌悬浮液，在SPA培养基上，或用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。

    在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。

4.4.4  冰核活性测定  用直径16 mm的螺口试管，装浓度大于16⁸ CFU/ml细菌液3–5 ml，加盖置于–4℃水浴中（水浴含11.2%的食盐水）。如此液在5 min内结冰，表明有冰核活性。

    在上述条件下，菌液经测定为无冰核活性。

4.5  碳素化合物的利用和分解

4.5.1  碳素化合物产酸试验  配制Ayers培养基。在适温下放置4–5 d后，每5 ml培养液接种0.1 ml含10⁸ CFU/ml 的菌悬浮液，适温下培养3–4周，产酸时培养液变为黄色。

    在此条件下，培养液变为黄色，能利用葡萄糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖产酸。

4.5.2  V. P试验（产生3–羟基丁酮试验）  将细菌接种于甲基红试验用培养液，培养2–4 d，按每毫升加40% KOH（含0.3% 肌酸或肌酐）0.1 ml溶液，置48–50℃水浴中，充分摇动2 h，在4 h内观察出现红色为阳性反应。

    在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。

4.5.3  甲基红试验（MR试验）  将细菌接种于葡萄糖蛋白胨培养液，适温下培养2–4 d以上，取培养液5 ml，加甲基红试剂2–3滴。培养液变红色为阳性反应，黄色为阴性反应。

    在此条件下，培养液测验为阴性反应，呈黄色。

4.6  氮素化合物的分解

4.6.1  硝酸盐还原试验  将硝酸盐半固体培养基用4% NaoH调节pH至7.0–7.2。每支试管分装5–10 ml培养基灭菌，针刺接种细菌。试管培养3、5、7 d后，分别用Griess–Liosesvary试剂测定法测定亚硝酸。如呈红色，表示有亚硝酸根为阳性反应。

    在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。

4.6.2  吲哚试验 

4.6.2.1  配制胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g 、蒸馏水1000.0 ml的培养液，接菌后适温培养。

4.6.2.2  将滤纸剪成小条，在饱和草酸溶液中浸过后取出，灭菌烘干后，夹在棉花塞和管壁之间，使滤纸悬挂在不接触培养液的液面上，有吲哚产生的滤纸变淡红色。

    在此条件下，滤纸不变淡红色，不产生吲哚。

4.7  大分子化合物的分解

4.7.1  明胶液化  在BPA培养基中加10%–12%的明胶，每支试管4–10 ml，在121℃灭菌12–15 min，冷却后用穿刺法接菌，在适温中培养3、7、14和21 d，将试管取出置冷水和4℃冰箱中，使明胶凝固，检查明胶是否凝固或液化，并以未接菌的明胶作对照。

    在此条件下，该菌株不能使明胶液化。

4.7.2  石蕊牛乳反应  用石蕊牛乳培养液，间歇灭菌3次，每次通蒸气20–30 ml。接种后于28℃条件下培养，以不接种的石蕊牛乳作对照，定期观察4–6周。

    在此条件下，石蕊牛乳反应变蓝，示有微碱性。

4.7.3  吐温80的水解  采用Sierra方法测定。将吐温80高压蒸气灭菌后，取10 ml加入蛋白胨10 g、CaCI·2H₂O 0.1 g、琼脂17 g、蒸馏水1000 ml，pH 7.4的培养基中，混匀后制成平板，点种细菌，适温培养7 d。如在菌落周围有不透明白色沉淀区出现，表示吐温80被水解，为阳性反应。

    在此条件下，吐温80能水解，为阳性反应。

4.8  其它生理生化试验

4.8.1  氧化酶试验  在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。

    在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应。

4.8.2  过氧化氢酶（接触酶）试验  挑取在固体培养基上生长24–48 h的菌苔，置于干净玻片上，滴加3%的过氧化氢，30 s内有大量气泡产生为阳性，不产气泡为阴性。

    在此条件下，菌苔过氧化氢酶试验为阳性。

4.9  致病性测定

4.9.1  烟草过敏性反应

    将在26℃条件下，培养72 d的菌株，用无菌水配成3×10⁸ /ml的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在24 ℃条件下经20–24 h后检查是否出现过敏性坏死斑。

4.9.2  植株致病性测定

    将分离菌株接种在植株健叶或休眠枝条上，菌液浓度6×10⁸ /ml。10–15 d后或次年2月下旬到3月下旬，检查是否出现典型叶斑症状，具晕圈；休眠枝条有溃疡症状及菌浓。

    根据上述检验结果，对照病原特征，鉴定是否为猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas  syringae pv. actinidiae Takikawa et al.

5  除害处理

5.1  禁止从疫情发生区调运染疫植物活体。

5.2  发现带疫植株应喷洒1万单位农用链霉素3000倍液、30%琥珀酸铜（DT）胶悬剂200倍液或70% 百菌通 500倍液分2–3次进行处理。

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