一、目的

掌握水中细菌总数的监测方法和卫生学意义

    国家标准规定的细菌总数监测方法为：标准平板计数法

一、原理

    细菌总数系指1克或1毫升检材中或1平方厘米表面所含的活菌数量，通过将处理后的检材在一定条件下培养后生长出来的菌落数（Colony form unit，CFU）计算细菌总数。

二、仪器设备及共用器材和试剂

1.高压蒸汽灭菌器；2.电热干燥箱；3.恒温培养箱；4.电冰箱；5.电热恒温水浴锅；6.电炉；7.放大镜；8.灭菌镊子；9.酒精灯：每组1只；10.灭菌棉球；11.营养琼脂；12.记号笔

三、材料和试剂

毫升无菌吸管一支；2.灭菌平皿3个；3.无菌采样瓶（管）1个

四、采样及样品处理

1. 采样容器必须先进行灭菌，并保证在运送、保存过程中不受污染。

2. 采自来水水样时，先用酒精灯将水笼头烧灼消毒，然后将水笼头完全打开，放水5-10分钟后采样，经常用的水笼头放水1-3分钟即可。

3. 采水源水时，应选择有代表性的地点及水质可疑的地方，一般应距水面0.2-0.5米深处采样。

4. 采集含有余氯的水样时，应在采样瓶中加入无菌的1.5%硫代硫酸钠溶液以中和水中余氯的杀菌作用，按每500毫升水样加2毫升计算。

5. 采样量应为瓶容量的80%，以便在检验时摇动。

6. 采集水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目，并应尽快检验，一般不超过2小时，放冰箱中保存也不应超过4小时。

五、操作方法

1. 将采样管（瓶）用力振荡80次，使可能存在的细菌充分分散开。

2. 用1毫升灭菌吸管吸取管内液（1:10稀释）1毫升，放入含9毫升生理盐水管中（1:100稀释），振荡10次或吹打混匀

3. 用另一支1毫升灭菌吸管吸取管内液（1:100稀释）1毫升，放入含9毫升生理盐水管中（1:1000稀释），振荡10次或吹打混匀，余此类推。

4. 用同一支吸管从高稀释度管开始分别吸取1毫升放入一个无菌平皿内，每个样品作两个稀释度，每个稀释度作两个平皿为平行样。

5. 于每个平皿中倾注15毫升左右已经融化并冷却到45℃左右的营养琼脂（化妆品的监测需用卵磷脂-吐温80营养琼脂），立即在平面上旋转平皿，使样品与琼脂充分混匀。每次检验时另用一个平皿只1毫升加灭菌生理盐水和15毫升营养琼脂作空白对照。

6. 待琼脂冷却凝固后，翻转平皿，使底面朝上，置37℃温箱中培养24小时后取出，计算平皿内菌落数，以同一稀释度的两个平皿内平均菌落数计算。

六、注意事项

1. 全部操作过程必须无菌。

2. 采集的样品应根据可能的细菌污染程度进行倍比稀释，并选择两个最适稀释度检验。如自来水以检测原倍水样为宜，一般的物体表面以1:10和1:100稀释较为合适，而化妆品应进行1:1000稀释，散装鲜牛奶以1:10000为宜。

3. 营养琼脂的温度不能过高和过低，而且必须与样品充分混匀。

七、菌落计数及报告方式

    平皿菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜观察，注意菌落与杂质的区别。

1. 计算同一稀释度的平均菌落数，若其中一个平皿内有较大片状菌落生长则不计该平皿；若片状生长的菌落未超过平皿的一半时可按菌落分布均匀的另一半平皿菌落数×2计算。

2. 先计算平均菌落数在30-300之间的平皿，如只有一个稀释度的平均菌落数在此范围，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告。若有2个稀释度的菌落数在此范围，则应按二者的比值来决定，若比值≤2则报告两者的平均数，比值＞2则报告其中较小稀释度的菌落数。

3. 如所有稀释度的菌落数均＞300，则报告最高稀释度的平均菌落数乘以其稀释度。

4. 如所有稀释度的菌落数均＜30，则应以稀释度最低的平均菌落数乘以其稀释度报告。

5. 如所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，应以最接近30或300的菌落数乘以其稀释倍数报告。

6. 菌落计数的报告，100以内时按实际数报告，＞100时采用二位有效数字的以10的指数形式表示。

7. 如菌落难以计数则应报告“无法计数”并注明稀释倍数。

八、结果计算

  CFU/毫升或克＝平均菌落数×稀释倍数

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