实验目的：学习并掌握分离纯化微生物的基本技能和筛选高效脱酚菌的实验方法

实验材料：

1．培养基

(1)      营养肉汤液体培养基。

(2)      营养肉汤琼脂培养基。

(3)      脱酚菌分离培养基：蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.05g，蒸馏水 1000mL，调pH7.2~7.4，固体培养基添加1.3%琼脂粉。

(4)      苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。此溶液每毫升含苯酚1mg。取此溶液10mL，移入另一100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用K₂CrO₄标准溶液对此溶液的酚浓度进行标定。

(5)      四硼酸钠饱和溶液：称取Na₂B₄O₇ 40g，溶于1L热蒸馏水中，冷却后使用，此溶液pH为10.1。

(6)      3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。

(7)      2％过硫酸胺溶液：取化学纯过硫酸胺2g，溶于蒸馏水，并稀释至100mL，冰箱保存，可用两周。

2．仪器 恒温振荡器、恒温培养箱、离心机、分光光度计。

3．其它 玻璃珠、锥形瓶、培养皿等

实验原理：

环境中存在着各种各样的微生物，其中某些微生物以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解。在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水常可选育特定的高效菌种进行处理。这些高效菌具有处理效率高、耐受毒性强等优点。本实验在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解试验等，可筛选出高效脱酚菌。

其中酚浓度的测定采用4-氨基安替比林法。其基本原理：4-氨基安替比林和酚类化合物在碱性溶液中和氧化剂铁氰化钾作用，生成红色的安替比林染料，与标准管比色，可测出水样中酚的含量。生成的色度在水中能稳定约30min，可在波长510nm处比色测定。本法最低检出浓度为0.1mg/L。

实验内容：

1．采样 为了获得酚分解能力较强的菌种，可在高浓度含酚废水流经的场所采样。如排放含酚废水下水道的淤泥．沉渣等，在这些地方分得的微生物往往降解酚能力较强。

2．富集培养 将样品置于装有玻璃珠的50mL液体培养基并加有适量苯酚的三角瓶中，30℃震荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取1mL转至另一个装有50mL液体培养基并加适量苯酚的三角瓶中。如此连续2~3此，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得脱酚菌占绝对优势的混合培养物。

3．平板的分离和纯化

（1）用无菌移液管吸取经富集培养的混合菌液0.lmL，注入9.9mL无菌水中，充分混匀，并继续稀释到适当浓度。

（2）取最后三个稀释管，分别自各管中吸取稀释菌液，滴一滴（约0.05mL）于固体平板（倒平板时添加适量的酚，最终酚浓度为50mg／L左右）中央，每个稀释度做2~3个重复。

（3）用无菌玻璃刮棒把滴加在平板上的菌液推平，盖好皿盖。室温放置，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱，培养1-2 d。

（4）挑选不同形态的菌落，在含适量酚的固体平板上划线纯化。平板倒置于30℃恒温箱，培养1～2d。

4．转接斜面 将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的试管斜面，30℃恒温箱培养24 h 。

5．降解试验 用接种环取各斜面菌苔一环，分别接种于100mL营养肉汤液体培养基中，振荡培养至对数生长期（30℃，约16~24h），在培养物中加入少量浓酚液，使培养液内酚浓度达到10mg／L左右，进行酚分解酶的诱发；继续振荡培养2h后再次加入浓酚液，使培养液酚浓度提高到50mg／L左右，继续振荡培养4h。

6．测定含酚量

(1)      取经降解的培养液，10000r/min离心10min后，取上清100μL加入到10mL的试管中，加蒸馏水到5mL，加100uL0.5mol/L的氨水，50uL的2%的4-氨基安替比啉，混均，再加入50uL的8%的铁氰化钾溶液，混均，15min后，在510nm处测吸光度。

(2)      计算酚含量，井算出酚的去除率。

酚／(mg·L^-1)=从标准曲线上查得的酚（mg）×1000/V

式中V：取测定样体积。

细菌脱酚率/%=（培养前酚浓度-培养后酚浓度）/培养前酚浓度*100%-酚挥发率（%）

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