1、 进一步加强学习、掌握玻璃器具等器材的清洗、烘干、包扎的包扎技术。

2、为下一次的课做好器材的准备工作。

二、原理

为确保实验顺利地进行，要求把实验所用的玻璃器皿清洗干净。为保持灭菌后和无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行包扎，对试管和三角瓶等加塞棉塞。这些工作看起来很普通简单，但如操作不当或不安操作规定去做，则会影响实验结果，甚至会导致试验的失败。

灭菌原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在121．3℃灭菌20分钟即可。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160—170℃），时间长（1—2小时）。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。

三、试剂和仪器

（一）仪器

高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱、试管、三角瓶、培养皿和吸管、棉线、纱布、棉花、牛皮纸、报纸、硅胶塞等

四、实验内容

（一） 玻璃器皿的清洗：

        新购的玻璃器皿的洗涤

将器皿放入２％盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，最后用流水冲净。

对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上晾干，即可使用。

        常用旧玻璃器皿的洗涤

确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后，可按常规用洗衣粉水进行刷洗；

吸取过化学试剂的吸管，先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。

       带菌玻璃器皿的洗涤

凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗：

1、带菌培养皿、试管、三角瓶等物品，做完实验后放入消毒桶内，用0.1MPa灭菌20～30 min后再刷洗。含菌培养皿的灭菌，底盖要分开放入不同的桶中，再进行高压灭菌。

2、带菌的吸管、滴管，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有3～5%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，再经0.1MPa灭菌20 min后，取出冲洗。

3、带菌载玻片及盖玻片，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有3～5%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，用夹子取出经清水冲干净。

如用于细菌染色的载玻片，要放入50g/ L肥皂水中煮沸10min，然后用肥皂水洗，再用清水洗干净。

        最后将载玻片浸入95%酒精中片刻，取出用软布擦干，或晾干，保存备用。

若用皂液不能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。

4、含油脂带菌器材的清洗

单独高压灭菌：用0.1MPa灭菌20～30 min→趁热倒去污物→倒放在铺有吸水纸的篮子上→用100 ℃烘烤0.5h→用5%的碳酸氢钠水煮两次→再用肥皂水刷洗干净。

（二）、玻璃器材的晾干或烘干

不急用的玻璃器材：可放在实验室中自然晾干；

急用的玻璃器材：把器材放在托盘中（大件的器材可直接放入烘箱中），再放入烘箱内，用80～120℃烘干，当温度下降到60℃以下再打开取出器材使用。

（三）器皿的包扎：

要灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。

（1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后进行灭菌。

（2） 吸管：洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4~5cm的纸条，以30~50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌。使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出试管。

（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。

目前，国内已开始采用塑料试管塞，可根据所用的试管的规格和试验要求来选择和采用合适的塑料试管塞。

若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用油纸包扎。

（四）、玻璃器材的灭菌

灭菌:干热灭菌:160～165℃烘箱中灭菌2h；或湿热灭菌:121 ℃ 20～30min

        干热灭菌法

1、将包扎好的玻璃器皿摆入电热烘箱中，相互间要留有一定的空隙，以便空气流通。

2、关紧箱门，打开排气孔，接上电源。

3、待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，加热至灭菌温度后，固定温度进行灭菌：160℃—165℃保持2小时。2小时后切断电源。

4、待烘箱内温度自然降温冷却到60℃以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

高压蒸汽灭菌法

1、关好排水阀门，放入纯净水或蒸馏水至标度。注意水量一定要加足，否则容易造成事故。

2、将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度（不要太紧），然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。

3、 通电加温，打开排气活门，排尽锅内的空气。通常当压力表指针升至5磅或0.05MPa时，打开排气活门放气，待压力表指针降至零点一小段时间后，再关闭活门。即活门冲出的全部是蒸汽时则表示彻底，此时可关闭排气活门，如果过早关闭活门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。

4、恒温灭菌: 0.1MPa 或15磅压力保持20～30分钟。压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至0.1MPa时或15磅时，锅内温度相当于120℃～121℃（等于一个大气压），此时开始计算灭菌时间，控制热源，使处于0.1MPa 或15磅压力保持20～30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。当达到所需温度时开始计时，并在此温度下保持所需的时间。

5、降温：自然降温或打开活门排汽降温。稍微打开一点排气活门，使锅内蒸汽缓慢排除，然后逐渐开大活门，气压徐徐下降，注意勿使排气过快，否则会使锅内的培养基沸腾而冲脱或沾染棉花塞，但排气太慢又使培养基在锅内，受高温处理时间过长，对培养基也是不利的。一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。

6、当锅内蒸汽完全排尽时即压力表指针降到零时，要立即打开锅盖。

7、取出灭菌物品：当锅内温度下降到60℃左右时器材或培养基。如培养基需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，冷却后便可收起。

8、最后将高压灭菌器内的剩余水排出。

9、观察灭菌效果。把灭菌培养基放入25℃温箱中，培养48小时观察灭菌效果。 48小时后不见杂菌生出，便证明培养基已达到灭菌目的，可以使用。

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