实验目的：了解食品微生物检验的过程，常用指标及检验结果评价。

实验内容：

 

细菌总数的测定

1 定义：细菌总数是指1g或lml食品，经过处理，在pH7．4～7．6的普通营养琼脂平板上,35～37⁰C培养24土2小时生长出来的细菌菌落总数。

2.实验试剂（1）琼脂  （2）生理盐水  （3）蛋白陈（4）牛肉膏  （5）氯化钠

3.实验仪器：1）采样瓶（2）平皿       （3）吸管  （4）试管   （5）孵箱

4.操作方法

（1）样品的采集与处理：

在采样和样品处理时，必须严格遵守无菌原则，采样后尽快检验。样品在室温下放

置最好不超过2小时，否则应置于冰箱内，在冰箱放置最长也不要超过12小时。

A 肉与肉制品的采集及处理：

（1）样品的采集

①生肉与内脏：如系屠宰场的猪，可于开腔后立即用灭菌刀采取两腿内侧肌肉509

左右；如果是鲜肉和冻肉，可用灭菌刀采取腿肉或其它部位肌肉5吨左右；，如系脾、        肾,可取其全部;如系肝脏，则取靠近肝门带有淋巴结部分。样品采后用无菌镊子夹入灭菌玻璃容器或塑料袋内立即送检，样品内不得放人任何防腐剂。

②熟肉及灌肠类：一般可取有代表性样品30～50克，肥瘦共存的肉，宜取瘦的，肥瘦难分或量不多时，要随机取样，灌肠类横断采样3～5块，样品取后放入灭菌容器内立即送检。

（b）样品处理。

凡由大块样品中采取一部分，一般均须在表面，以一烙板灭菌或沸水进行表面灭菌。再用灭菌剪子剪掉表面部分，在无菌条件下，取深层肌肉或内脏10g放人灭菌容器内，用灭菌剪子剪碎，加入灭菌河沙和灭菌生理盐水100ml研磨混匀制成1：10混悬液。熟肉及灌肠也可不用表面灭菌处理，而直接用无菌操作称取10g放入灭菌容器内研磨或剪碎，再按上法制成1:10混悬液。

b．乳与乳制品（鲜乳、炼乳、奶粉、酸奶等）。

(a)样品的采集

1.鲜乳：如在畜牧场直接取样，先将牛乳头用酒精棉球表面擦拭消毒，弃去开始挤下的头两把奶，然后再用灭菌容器接取，同一头牛应在各乳头上各取一部分。如在奶站或销售点，可用灭菌采样器采取不同部位有代表性的样品，采后不加防腐剂，立即送检。若为同一批瓶装奶则随机取2～5瓶送检。

2.乳制品。最好采取原装样品，如无原装者，要用灭菌容器取不同部位有代表性的样品送检。

（b）样品处理：

1.     鲜乳：以无菌操作，直接用吸管取10ml加入90ml生理盐水作成1： 10稀释液（需用原液者例外）。

2.     奶粉：无菌称取10g样品，放入预温至45⁰C的生理盐水90m1，溶后混匀制成1： 10稀释液。

3.     炼乳、酸乳：将瓶口或铁筒的表面用点燃的酒精棉球消毒，然后用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开罐器开封，无菌称取10g样品放入灭菌容器内，加灭菌生理盐水90ml振摇均匀，制成1:10稀释液。

4.     奶油；将块状样品用灭菌刀取10g，加90ml生理盐水，放入45⁰C 水浴中熔化，摇匀制成1:10稀释液。

C．蛋品: 

（a）样品采集：

  鲜蛋：取完整的鲜蛋放入无菌袋内送检。

  干全蛋，于蛋黄和干蛋白:将包装箱开口处用75％酒精棉球消毒后打开,用无菌采样器斜角插入箱底，使样品填满采样器，抽出采样器，用灭菌匙分上、。中、下各取  50g装人250ml广口瓶，混匀，送检。

 冰蛋:如生产过程中，每半小时取样一次，每次约200g，如是冷藏品,需用无菌钻头钻取，放人无菌容器内送检。

(b) 样品处理：

① 鲜蛋：用肥皂水将蛋壳洗净后，放入0.1％升汞溶液浸泡10分钟，然后用灭菌棉花擦干，表面覆盖消毒纱布。在打开蛋壳前，先用3％碘酒悄毒，再用灭菌刀敲破使蛋液流入事    先灭菌过的装有玻璃珠的三角瓶内，充分振摇使其混合均匀。无菌操作称取109放人事先灭菌过的装有玻璃珠的三角瓶内，并加90ml灭菌生理盐水，混匀。

② 干全蛋、干蛋黄、干蛋白：按无菌操作称取10克放入灭菌容器内，加90ml生理盐水混合均匀。

③     冰蛋：冷冻的冰蛋需放入流动的冷水盆内,待熔后用无菌操作称取10g放入事先灭菌过的装有玻璃珠的三角瓶内，加90ml生理盐水并振摇混匀。

 d、清凉饮料：

（a）样品的采集：瓶装汽水、果子露、果味水、鲜果汁水、酸梅汤等，应采原包装样品送检。冰激淋、刨冰等样品按无菌操作采集后放入灭菌容器内，再置于冰壶或隔热容器中送检。冰棍采取原包装放入灭菌容器中送检。

（b）样品处理：

①汽水、果子露、鲜果汁和酸梅汤等

  用点燃的酒精棉球烧灼瓶口消毒。用石碳酸纱布盖好，再开启瓶盖，并迅速换一灭        菌棉塞轻轻振摇待气体全部逸出后，进行检验。

②冰棍用无菌镊子，除去包装纸，再用灭菌剪子剪掉木棒使样品落入事先灭菌的500ml广口瓶内，使其熔化，并应在熔化后半小时内接种完。

 e。与食品有密切关系的工具、食具、人手等样品的采集与处理：首先在被检对象（样品）上确定取样的表面部位，然后用限定面积的规格板压在该处，再用蘸有灭菌生理盐水的棉拭子稍加挤压后旋转涂擦被检物表面，将此棉拭子头部剪入盛有10ml灭菌生理盐水的管内。再取一支棉拭子，重复上述操作，棉拭子头一并剪人原管内。

（2）样品稀释与倾注培养。

1.无菌操作将固体检样 10g（或液体检样 10d即上述处理混悬液的上清液或原样）放入含有100ml（如样品为液体则改为90ml）灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或乳钵内。经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液（或样品已处理制成1：10混悬液，此步即省略）。

2.用1ml灭菌吸管吸取l：10稀释液1ml注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100稀释液。

3.另取1m1灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用一支lml灭菌吸管。

4.根据样品污染情况，估计选择2～3个连续适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取该稀释度的溶液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度作二块平皿。

5.稀释液移入平皿后，应立即将冷至 45⁰C的营养琼脂培养基(可放45⁰C水浴保温)倾注平皿约15m1，并转动平皿使混合均匀。

6.待琼脂凝固后，翻转平皿置37⁰C温箱内培养2 4士2小时。

    附稀释步骤图示：大肠菌群与细菌总数同时进行．

（3）菌落计数原则。

每一样品的可计数平皿应选取两个以上。

a选取菌落数在 3O～ 300之间的平皿作为可计数平皿。

b，平皿菌落数不在30～300之间，。又限于条件无法重新采样检验，可按下列原则作为可计数平皿。

1）所有平皿上菌落数均少于30，则以低倍稀释平皿作为可计数平皿。

2）所有平皿上菌落数均大于300，则以高倍稀释平皿作为可计数平皿。

3）平皿上菌落弥漫生长，但弥漫部分不超过平皿面积1/2，其余1/2面积上菌落密度仍符合上项要求者，仍可列为可计数平皿。

C,如因平皿上菌落弥漫生长无法计数或菌落分布不合理，即高倍稀释平皿上的菌落数反而比低倍稀释平皿上菌落数多。结果只能作废，应重新检验。

（4）菌落计数方法

（5）菌落数的计算与数字处理

1）  菌落数*稀释倍数=每g(ml或cm²)样品的菌落总数。

2）  如果几个稀释度均有可计数平皿时，在分别计算各种稀释度相当样品的菌落总数后，按下列原则取最后结果。

若有两个稀释度，如果其比值小于2，则报告其平均数；如大于2，则报告其中较小的数字。若有三个稀释度，其中有两个其比值小于2，另一个相差较大时，则取前两个数值的平均数。

c.最终数值取两位有效数字，报告结果。