临床微生物学检验发展的现在时

 

(一).现代医学微生物学的任务和地位

 

目前临床微生物学的研究趋向于以下的发展与分化:

 

1.与临床医学渐分离,利用微生物作为工具或从微生物遗传学方面从事分子生物学理论和实践的研究。

 

2.继续进行病原微生物的生物学特征,与机体的相互作用,特别是其致病机理及防治的研究。

 

3.紧密联系临床,利用医学微生物学的知识和技术,研究感染性疾病的病原学检验,不断提高诊断的快速性和准确性,探讨控制细菌耐药性发展的对策和防止医院内感染的措施而形成了临床微生物学这一新的领域。

 

4．临床微生物学的主要任务可以归纳为:

 

1）研究感染性疾病的病原学特征

 

感染性疾病包括传染性(传染病)和无(或低)传染性者,其病原可为有毒力的病原微生物和无(或低)毒的条件致病菌.近年来由感染病人临床标本分离的细菌约60%-70%为革兰阴性菌,而以往认为是"正常的细菌"致病性在不断增强,更有一些植物致病菌,环境中的自然菌引起的疾病,所有这些病原菌的都需要我们对其的特性包括耐药性进行研究.

 

2）提供快速,准确的病原学诊断

 

临床微生物学工作者(微生物学检验医师)要承担临床标本检验方法学的研究和评价,提高检验质量以及正确解释检验结果,并将其转化成临床信息的双重任务.由于同一种病原体在不同情况下可以表现有不同作用或引起不同感染,以及同一疾病可以由多种病原体所致,如腹泻;特别是现代病原体临床感染的特点,增加了病原学检验的难度和复杂性.所以临床微生物工作者应该为提供快速准确诊断病原体而努力.

 

3）指导合理应用抗生素

 

临床微生物工作者除完成由临床标本检出病原体外,还应掌握抗菌治疗的最新进展,迅速对分离病原体抗生敏感性分析,参与对病人治疗方案的制定,提出进一步合理用药的建议.由于人体内抗菌药疗效会受到诸如药物吸收,渗透,体内失活和其他细菌的作用等因素的影响,同时也要考虑用药途径和u病人状况(肾,肝功能和免疫状态)等特点,临床微生物学工作者必须加强与临床医生的合作,避免盲目使用药物和忽视病人情况,单纯依据实验室结果选择药物和剂量的两种倾向,以便充分发挥抗生素的治疗作用,防止不恰当用药所造成的不良后果.

 

4）对医院感染进行监控

 

医院感染指发生在医院中的一切感染,包括因插入性器械操作等引起的外源性感染和自身正常菌群所致的内源性感染.据世界卫生组织调查,各国医院感染患病率约3%-20%,平均约9%。临床微生物学对于医院感染特点,发生因素,实验室监测, 控制措施等研究负有不可推卸的责任。在医院感染中的微生物学检验和医院环境的微生物学调查,保证灭菌,消毒的质量,推动抗生素的合理使用,以及建设和执行医院的卫生制度和措施等方面起重要作用。

 

5）流行病学分析：

 

必要是对收集和保留菌种作用源性确定，追踪传染源表型分析如生物型（生化反应菌落形态，环境耐受性等）耐药谱，血清分型，嗜菌体和细菌素分型，电泳蛋白分型和免疫印迹分型，多点酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis）,质粒分析，染色体DNA的取胜制性内切酶分析，限制性片段长度多态性的Southern印迹，染色体DNA脉冲电场凝胶电泳PCR杂交分型等。

 

（二）、目前多数临床微生物实验室现状

 

可以说与临床微生物学任务和地位所要求的相去很远，表现为以下几方面：

 

1、从临床实验室角度来看，认识观念落后，表现为：

 

1）.领导重视不够，政府有关部分对细菌检验的收费定价过低较为严重影响临床细菌学检验的分离，培养，鉴定和药敏分析等质量。检验科领导从总的情况分析，多半为从事生化，对细菌室重视不够，大医院要好一些，小医院中，目前不少地区的医院仍将细菌室作为缓冲室可有可无，细菌检验可做可不做，硬件、软件落后，缺少专家。尤其是又懂临床，又懂微生物学和药理学的专家。

 

2）.实验室所用的检验技术落后：

 

采样及样本容器的不规范。比如痰样，尿样，便样，更不用说厌氧菌培养样本等，忽视在分析前的质量保证。

 

样本运送的不畅通；如采好的痰液和尿液不能及时的送检。

 

分离培养的不标准；如一个痰液培养应该使用几种平板，应该有什么样的培养环境等等。

 

菌种鉴定的不标准：有的用自配的糖发酵管；有的使用微量管法；有的使用板块法；还有的什么生化反应也不做靠,单操作者个人的经验观察菌落形态而鉴定细菌；有的使用数值法鉴定，如11项生化反应编码；少数大医院使用全自动的细菌鉴及药敏分析系统。

 

细菌药敏检测方法的不规范：使用K-B法检测却没有对药敏平板及药品纸片进行定期的检测德行。

 

报告结果单纯，就事论事，没有结临床作任何解释。也不关心你所报告的结果与临床的相符性是多少?如尿路感染，败血症呼吸道感染，嗜血杆菌感染，所报告的微生物与该病人所患的疾病的关系怎样?选择药敏的抗生素，临床选用率是多少？治疗后的结果怎样？有多少报告的结果你会与临床主动联系？对临床病人的病情有多少了解和关心？……

 

保存不重视，极大多数实验室根本不保存分离菌种使得对有问题的报告无法再次做鉴定和进一步研究。

 

对细菌分离情况及其耐药性的统计重视不够，无法对临床的用药进行指导与监控。

 

实验室对送达的样本登记及各种实验的记录重视不够。

 

目前多半实验室仍是一条腿走路，仅限于对常见的普通细菌和鉴定，药敏，对一些难于分离培养的细菌如嗜血杆菌，L型细菌，支原体，厌氧菌，真菌,等缺乏认识和培养（包括深部和浅部）鉴定技术。

 

我国也与世界各国一样面临着感染菌的耐药性日益增多的威协,尽管新的抗生素不断地研制和生产,但耐药菌尤其是多重耐药菌的递增越来越给人类增添麻烦,近年来临床微生物学检验手段逐渐提高,取得较为明显的进步,但至今仍是检验医学各学科中较为薄弱的环节,目前国内药敏试验中存在的主要问题是:

 

1.我国卫生部推荐的是按美国NCCLS推荐纸片扩散法(K-B法)和肉汤稀释法MIC,但目前所用的方法仍未统一和标准化.

 

2.市场的供的药敏试验的培养基,药敏纸片及MIC稀释板等缺乏严格的质控,质量难于保证.

 

3.细菌检验队伍力量薄弱,从检人员知识老化,(基础和专业教学与临床严重脱节),缺乏对新技术,新方法,新信息以及标准化的了解,例如抗生素的选择,影响结果的多因素分析,临床知识,耐药性的产生机理,对可能出现错误率和矛盾缺乏认识、意见和解释.

 

4.药敏结果报告慢,尤其是临床实验室脱离临床,缺乏沟通一致使药敏试验结果不能满足临床治疗所需.

 

(3) 实验室管理上存在问题：

 

a).室内室间质控目的不明确，室内质控形同虚设，不知道该做些什么?室间质控只追求结果的正确，而不管结果是怎么来的?结果和成绩水分较大.

 

b).室内人员轮转太频,严重影响临床微生物学的检验,科研,教学及院感监控等工作.

 

c).缺乏高层次的专家,师傅水平不高.

 

d).与临床联系不够。

 

2.从临床的角度来看：

 

a.由于实验室技术落后无法及时给临床提供准确有用的报告，或提供的报告与临床症状差距很大不能对临床治疗起作用，使得临床医生对实验室失去了信心，不愿开申请单，而凭经验用药。

 

b.由于临床医生对细菌方面的知识有限，对细菌引起感染及经验用药造成的负面影响认识不够，造成对细菌检验的不重视。

 

c.临床医生对目前临床分离细菌的耐药谱了解不够，造成了盲目用药与细菌耐药性不断增加这一恶性循环。

 

从临床分离到的细菌来分析，多耐药细菌的广泛存在，如MRSA、MRS-CON、VRE、PRSpn、ESBLS不断的增加；使得抗菌素的使用将或已经进入抗菌素的后时代。

从我院98年1-6月份统计的资料示：MRSA的分离率为73.6%，MRS-CON为82.3%，ESBLS菌的分离率ICU为43.6%，普通病房为29.8%，所幸尚未发现有VRE和PRSpn，其耐药的势头相当不乐观。

 

临床医生与实验室联系疏松，认识模糊，随便用抗生素，滥用抗生素，尤其是广谱抗生素，菌群失调，耐菌性筛选和诱导。

a.由于实验室技术落后无法及时给临床提供准确有用的报告，或提供的报告与临床症状差距很大不能对临床治疗起作用，使得临床医生对实验室失去了信心，不愿开申请单，而凭经验用药。

 

b.由于临床医生对细菌方面的知识有限，对细菌引起感染及经验用药造成的负面影响认识不够，造成对细菌检验的不重视。

 

c.临床医生对目前临床分离细菌的耐药谱了解不够，造成了盲目用药与细菌耐药性不断增加这一恶性循环。

 

d.从临床分离到的细菌来分析，多耐药细菌的广泛存在，如MRSA、MRS-CON、VRE、PRSpn、ESBLS不断的增加；如耐万古霉素的金葡萄和ESBL菌不断增多,人类将步入抗菌素后时代.。

 

从我院98年1-6月份统计的资料示：MRSA的分离率为73.6%，MRS-CON为82.3%，ESBLS菌的分离率ICU为43.6%，普通病房为29.8%，所幸尚未发现有VRE和PRSpn，其耐药的势头相当不乐观。

 

e.临床医生与实验室联系疏松，认识模糊，随便用抗生素，滥用抗生素，尤其是广谱抗生素，菌群失调，耐菌性筛选和诱导。

 

(5).药敏试验中抗菌药物的选择：

 

原则上按NCCLS推荐者的依感染菌的属种来选择抗生素组别，另外就是选择代表性药物，人类目前所用的抗生素，绝大部分可归几个族（Family）如β-内酰胺类，氨基糖甙类，喹诺酮类等等，同一类抗生素中如头孢菌素类抗生素是一族广谱半合成抗生素，自链霉菌获得的β-内酰按类抗生素有A，B和C三型，以C型的抗菌作用强,即其母核为由头孢菌素C裂解而获得的7-氨基头孢烷酸（7ACA），头孢菌素类具有抗菌作用强，耐青霉素酶，临床疗效高，毒性低，过敏反应较青霉素类少等优点.根据抗菌谱对革兰阴性杆菌抗菌活性的不同而分为三代，第一代头孢如头孢噻吩，头孢噻啶，头孢唑啉，头孢硫脒，头孢拉啶，头孢氨卞，头孢羟氨卞等虽对青霉素酶稳定，但仍为许多革兰阴性菌所产生的β-内酰胺酶所破坏，因此仅主要用于产青霉素酶的金葡菌和某些革兰阴性菌感染，第二代头孢如头孢孟多，头孢呋新，头孢克罗，头孢替安等对多数的β-内酰按酶稳定，其抗菌谱较第一代广，对革兰阴性菌的作用较第一代强，但对肠杆菌科细菌和绿脓杆菌等活性仍差.第三代头孢如头孢噻肟，头孢唑肟，头孢甲肟，头孢三唪等对多种β-内嗪胺酶稳定，对革兰阴性菌的抗菌活性甚强，包括对假单胞菌属较强活性的第三代头孢菌素如头孢他啶，头孢哌酮，头孢磺啶，头孢咪唑，头孢匹罗等.由于常规的分类是按抗生素结构分类，同一类或同一族抗生素彼此相关，即同族各抗生素的作用方式，抗菌谱类同，同样它们也会被同样的耐药机制所影响（交叉耐药）。当然也有些药物，如大环内的酶类，林可酰胺和链阳菌素等抗生素尽管化学结构完全不同，都有同样的细胞内靶位，在体外抗生素敏感试验结果判续时可作为同一功能组。

 

综上所述,现时就迫切需要临床微生物学者接受多方面的知识（化学结构，作用方式，耐药机理及对应的表型，天然耐药性，体液及组织中的药代动力学，代谢，细菌群体中的MIC分布，体外测试结果与治疗效果的关系等），当然仍有不少耐药机制迄今仍尚未明了，也会有新的耐药机制产生及旧的耐药机制发生不断地改变.目前临床微生物学检验中多半选择各类抗生素中代表性药物，例如选用青霉素，新青类宜用氨苄青霉素；氨基糖甙类宜用卡那霉素，大环内脂类宜用红霉素，喹诺酮类宜用环丙少星或氧氟沙星等，同时可选用提示性药物（Predictordrug）即细菌对此种药物耐药可提示对同类药物耐药，如葡萄球菌对Oxacillin耐药提示对所有β-内酰胺类抗生素均耐药，也会对氨基糖甙类及Imipenem耐药；耐庆大霉素的细菌对氨基糖甙类均耐药；头孢他啶或氨曲南耐药提示产生超广谱β-内酰胺酶（ESBL`S）。

 

（三）、面对当前的现状我们所选择的对策

 

首先从领导层开始应该改变观念，充分认识临床微生物学检验的重要性。而要他们改变就要靠我们这些从事临床微学生物检验人员付出艰巨的工作；其次要提高实验室人员的技术水平及整个实验室的硬件质量。

 

1.细菌室由于工作的特殊性应配有不需轮转的技术水平较高的人员。

 

2.制定适合本室使用的各项规章制度。

 

3.按培养要求选择高质量的培养基和适合各种细菌生长的环境条件，如CO2浓度、厌氧环境、温度等等；痰液的培养至少需用三种培养基，5-8%脱纤维绵羊血的哥轮比亚琼脂用于普通的革兰阳性和革兰阴性菌培养，沙博培养基用于分离酵母菌，巧克力平板用于分离奈瑟菌和嗜血杆菌。

 

4．大力宣传推广NCCLS的标准化方法认真执行室内的质控要求加强分析前的质控（中的样本及分析后的质控审核发送报告，反馈临床信息，密切联系临床。

 

5.对市售的药敏培养基，药敏纸片，NIC稀释板等进行严格的控制保质量。

 

6.试验用的抗生素及临床常用抗生素应由医院控制院感委员会中临床医师药物学及微生物学专家共同按实际情况选定和查审。

 

7.加强地区间，国际区合作交流，学习新方法，引进新技术和配置必要的先进的仪器设备，加强硬件和软件的投资，综合培训从检人员的素质，重视临床微生物学检验队伍的建设，强化培养懂临床并参与临床的懂实验室操作的专家。

 

8.密切监视耐药菌群如耐药万古霉素的葡萄球菌，耐万古霉素和耐高浓度氨基糖甙类的链球菌，耐青霉素的肺炎链球菌，β-溶血链球菌和脑膜炎双球菌；耐头孢曲松和淋病奈瑟菌，耐Imipenem的肠杆菌及超广谱β-内酰胺酶的ESBL`S菌在我国出现和传布。

 

9.按各实验室的条件选择最好的鉴定和药敏检测系统；目前可用于细菌鉴定和药敏检测的高质量系统国内还很少；国际上公认的细菌鉴定标准为法国生物默里埃公司的API鉴定系统及ATB药敏分析系统。当然条件许可可配置半自动或全自动细菌鉴定药敏感分析仪。。

 

我科于96年开始使用VITEK CC2细菌鉴定药敏分析仪，其上好性能给我室细菌检测水平提高起到了很好的促进作用。加深了与临床的沟通使临床医生与实验室的关系进入了良性循环。

 

在使用GNI或GNI+卡鉴定的2015株革兰阴性杆菌中约97%（1955株）得到准确鉴定及药敏结果，而另外3%的细菌通过修改1-3个生化反应结果或按提示增加生化试验得到鉴定。用YBC卡鉴定的423株酵母菌中，86.1%（353），24h鉴定出来，13.9%48h鉴定出来，菌种分布17种。用GPI卡鉴定1684株革兰阳性菌中92.5%可直接得到鉴定，2.5%需经修改生化结果后得到鉴定，另有5%仍无法鉴定，这此细菌多数为革兰阳性的杆菌，改用API棒状杆菌或李斯特菌鉴定条得到鉴定，在鉴定出的革兰阳性菌中几乎包括了所有临床能见的葡萄球菌和链球菌以及部份棒状杆菌。当然对部分结果还离不开手工或E-test的进一步验证和分析.

 

此外，本仪器所设置的专家系统及统计系统给实验室提判定和分析高水平的作用也。其统计系统功能也十分强大。