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水中大肠杆菌mTEC培养基检验方法-滤膜法



录入时间:2010-9-16 14:04:21 来源:互联网

一、       方法概要
本方法系以0.45 μm孔径之滤膜过滤水样,检测水中大肠杆菌(Escherichia coli)。水样过滤后置于mTEC培养基(modified membrane-Thermotolerant Escherichia coli Agar,缩写为modified mTEC Agar)上,于35±1℃培养2小时,再以44.5±0.5℃培养22~24小时,大肠杆菌会形成红色或紫红色菌落。
方法原理是培养基内含之色原(5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸,5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)被大肠杆菌之尿甘酸化酶(β-D-glucuronidase)催化而产生红色或紫红色菌落。
 
二、       适用范围
本方法适用于饮用水水质、饮用水水源水质、地面水体、地下水体、废水、污水、及海水等水样中大肠杆菌之检验。但不适于高浊度及含有干扰物质水样之检测。
三、       干扰
(一)    水样中含有抑制或促进大肠杆菌生长之物质时,会影响水样之检测结果。
(二)    检验使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌生长之物质时,会影响水样之检测结果。
(三)    悬浮微粒过高或含有胶体的水样易造成滤膜孔隙阻塞,或造成细菌菌落弥漫生长(Spreading)而影响水样检验结果之判读。
 
四、       设备
(一)    量筒:一般使用100~1000 mL之量筒。
(二)    吸管:一般使用1~10 mL之灭菌玻璃吸管或无菌塑料吸管,应有0.1 mL之刻度。
(三)    稀释瓶: 100~1000 mL能耐高压灭菌之有盖硼硅玻璃制品。
(四)    三角锥瓶:250~2000 mL能耐高压灭菌之硼硅玻璃制品。
(五)    采样容器:无菌之玻璃或塑料制有盖容器,使用市售无菌袋亦可。
(六)    培养皿:硼硅玻璃或可抛弃式塑料制培养皿。可使用60×15 mm、50×12 mm或其它适当大小者。
(七)    过滤装置:能耐高温高压灭菌之玻璃、塑料、陶瓷或不锈钢等材质构成之无缝隙漏斗,以锁定装置、磁力或重力固定于底座。
(八)    抽气帮浦:水压式或吸气式,压力差最好在138至207 kPa者。
(九)    滤膜:使用直径47 mm、孔径0.45 µm且有格子记号的无菌滤膜,能使水中大肠杆菌完全滞留者。
(十)    镊子:前端圆滑内侧无波纹。
(十一)水浴槽:温度能维持在50℃左右者。如用于44.5℃培养,温度必须能维持在44.5±0.5℃。
(十二)培养箱:温度能维持在35±1℃者。如用于44.5℃培养,温度必须能维持在44.5±0.5℃。
(十三)       加热板:附磁石搅拌功能者。
(十四)       天平:能精称至0.01 g者。
(十五)       高压灭菌釜:能以中心温度121℃(压力约15 lb/in2或1.1 kg/cm2)灭菌15分钟以上者。
(十六)       烘箱:用于玻璃器皿等用具之干热灭菌,温度能维持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
 
五、       试剂及材料
本方法所使用的化学药品均为试药级,培养基为微生物级制品。
(一)    培养基
mTEC培养基(modified mTEC Agar)成份:
3号蛋白胨(Protease Peptone #3)      5.0 g
酵母抽出物(Yeast Extract)   3.0 g
乳糖(Lactose) 10.0 g
氯化钠(Sodium Chloride)      7.5 g
磷酸氢二钾(Dipotassium Phosphate)   3.3 g
磷酸二氢钾(Monopotassium Phosphate)     1.0 g
硫酸月桂酸钠(Sodium Lauryl Sulfate) 0.2 g
脱氧胆酸钠(Sodium Desoxycholate)    0.1 g
5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸(5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)       0.5 g
琼脂(Agar)     15.0 g
使用市售商品化培养基45.6 g,加入1公升的蒸馏水,煮沸溶解后以121℃高温高压灭菌15分钟,培养基最终pH值应为7.3±0.2。取出后置于45~50℃之水浴槽待温度下降至恒温,培养基混摇均匀后分装于培养皿中,厚度约3~5 mm。凝固后避光保存于冰箱中备用,分装后之培养基保存期限为14天。可依检测需要量按比例适量配制。
(二)    无菌稀释液
       无菌稀释液一:非海水水样检测稀释用。配制方法如下:
       磷酸二氢钾储备溶液
取3.4 g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于50 mL的蒸馏水中,待完全溶解后,以1.0 M NaOH溶液调整其pH值为7.20±0.05,然后加蒸馏水至全量为100 mL,灭菌(过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟)后,储存于冰箱中作为储存液备用。
       氯化镁储备溶液
取8.1 g氯化镁(MgCl2‧6H2O)先溶于少量蒸馏水,待完全溶解后,再加蒸馏水至全量为100 mL,灭菌(过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟)后,保存于冰箱中作为储存液备用。
       无菌稀释液
分别取10 mL氯化镁储备溶液和2.5 mL磷酸二氢钾溶液,加入蒸馏水至全量为2000 mL,混摇均匀后,分装于稀释瓶中,经121℃高温高压灭菌15分钟,作为无菌稀释液备用。
       无菌稀释液二:海水或含盐水样稀释用。
磷酸二氢钠(NaH2PO4)  0.58 g
磷酸氢二钠(Na2HPO4)  2.50 g
氯化钠(NaCl) 8.50 g
将上述成分溶解于1公升的蒸馏水中,混摇均匀后,分装于稀释瓶中,经121℃灭菌15分钟,其灭菌后之pH值为7.4 ±0.2。
六、       采样与保存
(一)    采取微生物检测之水样时,应使用清洁并经灭菌之玻璃或塑料容器或市售无菌采样袋。且于采样时应避免受到污染。水样若含有余氯时,无菌容器中应加入适量无菌之硫代硫酸钠(120 mL的水样中加入0.1 mL、10﹪的硫代硫酸钠可还原15 mg/L的余氯)。
(二)    水样运送及保存之温度应维持在0~5℃并于采样24小时内完成检测。
(三)    水样量以能做完所需检测为度,但不得少于200 mL。
七、       步骤
(一)    水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上,以使样品充分混合均匀。
(二)    水样稀释:
       饮用水水样不需稀释。
       其它样品则视水样中大肠杆菌可能浓度范围进行水样稀释。
使用无菌吸管吸取10 mL之水样至90 mL之无菌稀释液中,形成10倍稀释度之水样,混摇均匀。而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列之100、1000倍等稀释水样,并混摇均匀。进行上述稀释步骤时,均需更换无菌吸管。
(三)    以无菌镊子夹起无菌滤膜,放在无菌过滤装置之有孔平板上,小心将漏斗固定。将过滤装置接上抽气帮浦。加入适量无菌稀释液,以测定过滤设备是否装置妥当。
(四)    检验饮用水水样时,直接过滤100 mL的水样。其它水样视大肠杆菌可能浓度范围,以无菌吸管吸取10 mL的原液及(或)各稀释度水样至无菌过滤器中过滤。过滤后,再以20至30 mL之无菌稀释液冲洗漏斗。每个稀释度水样均需进行两重复。
(五)    冲洗过滤后,解开真空装置,将漏斗移开,尽速以无菌镊子取出过滤后之滤膜置于培养基上。滤膜应与培基完全贴合,避免产生气泡。培养皿倒置于35±1℃的恒温培养箱中培养2小时,然后再于44.5±0.5℃的培养箱或水浴槽中培养22~24小时。如放置于水浴槽中培养,应将培养皿倒置密封于防渗水塑料袋内(如采样袋),塑料袋须完全浸入水中。如使用松盖培养皿放置于培养箱中培养,应将培养皿放置于密闭容器中,且容器内侧底部应放置湿纸巾或湿布,以避免培养基之水份丧失而影响细菌生长。
(六)    过滤不同稀释度水样时,应更换无菌过滤器(漏斗)。亦可将过滤器(漏斗)以火烤后约降至室温重复使用。
(七)    计算并记录各稀释度培养皿中所产生的红色或紫红色菌落。若菌落过多造成判读困难,则以「大肠杆菌菌落太多无法计数」(E. coli Too numerous to count ; TNTC)表示。
八、       结果处理
(一)    选取大肠杆菌菌落数介于20至80间之同一稀释度的两个培养皿,计算其每100 mL水样之大肠杆菌菌落数,单位为CFU/100mL。计算公式如下:
大肠杆菌菌落数=所选取培养皿之红色或紫红色菌落数×100(CFU/100mL) 所选取培养皿之实际水样体积总合
(二)    培养皿之大肠杆菌菌落数不在20至80个菌落之间时,则以下列方式处理:
       若原液及各稀释度水样中仅有一个稀释度的一个培养皿菌落数在20至80 个之间,则选取该稀释度的两个培养皿以上述公式计算之。
       若仅原液有大肠杆菌菌落产生,且少于20个,应循上述公式计数菌落数;若过滤100 mL原液,培养皿中均无菌落生长,则结果以「<1 CFU/100mL」表示;若过滤10 mL原液,培养皿中均无菌落生长,则结果以「<10 CFU/100mL」表示。
       若各培养皿之大肠杆菌菌落数均不在20至80个之间,则选取大肠杆菌菌落数最接近80之同一稀释度的两个培养皿以上述公式计算。但不可选用菌落总数大于200之培养皿。
(三)    数据表示:菌落数小于100时,以整数表示(小数字四舍五入),菌落数大于100 以上时,取两位有效数字,并以科学记号表示,例如菌落数为112时以1.1×102 表示之,菌落数为117时以1.2×102 表示之,菌落数为65000时以6.5×104 表示。
(四)    检测纪录必须注明采样时间、开始培养时间、结束培养时间、培养基名称及各稀释度的原始数据。
九、       质量管理
(一)    微生物采样及检测人员应具备微生物基本训练及知识。
(二)    进行微生物检测时,所用的盛装器具均应经灭菌处理。
(三)    每次采样时,应进行一组运送空白及野外空白。
(四)    每批次或每10个水样须进行一次试剂空白。
(五)    新购之mTEC培养基,每批次均须以已知的大肠杆菌及非大肠杆菌(例如Bacillus subtilis)之菌株作测试,以确保数据质量。
(六)    若连续一个月水样均未检出大肠杆菌,则须以大肠杆菌菌株进行培养基测试,以确保数据质量。
(七)    应记录所有稀释度水样的原始数据,以备查核之用。
(八)    每个稀释度水样至少须进行二重复。
(九)    本方法培养所得之细菌可能具有感染性,检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。
 

 

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