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《水生微生物实验法》——水中霍乱弧菌的分离检验



录入时间:2010-9-13 13:52:59 来源:青岛海博

感染了霍乱弧菌可能引起急性传染病——霍乱.1883年世界上霍乱大流行时,科克(Koch)在埃及的病人体内分离培养而且获得证实霍乱弧菌的存在。解放后在我国没有发现此疾病的流行。但由于病人的吐泻物可能污染水源,不能保证在辽阔的沿岸、港湾、河口等处没有霍乱菌的存在,因此对水源中霍乱弧菌的分离检测,有利于预防霍乱疾病的发生。
1 .培养基制备
(1)碱性蛋白胨水培养液:
NaNO3  2 克
NaCl   5 克
蛋白胨10 克
蒸馏水1000 毫升
将上述三种成分溶解于水后,用15%氢氧化钠溶液约10 毫升调pH 为8.8-9.0.于121℃下灭菌20 分钟。
(2)雪氏(Senenray )蛋白胨水.
蛋白胨20克
NaCl 30 克
蒸馏水1000毫升
将前两种溶解于水.调pH8.4,于121℃ 蒸汽下灭菌20分钟。
(3)阿伦森氏(Aronson )培养基:
3%肉膏琼脂(pH7.4-7.6) 100 毫升
10%无水Na2CO3溶液5-6 毫升
20%蔗糖溶液5毫升
20%糊精溶液3毫升
碱性复红酒精饱和溶液0.4 毫升
10 %无水Na2SO3溶液2 毫升
制法如下:
① 将己灭菌的肉膏琼脂加热溶化加入碳酸钠溶液6 毫升混合。
② 加蔗糖、糊精、复红及亚硫酸钠溶液,混合,置于阿诺德氏灭菌器内,以间歇蒸汽灭菌15分钟,此时可有部分沉淀形成.
③ 将上层清晰的培养基倒于培养皿,制成平板,备用。但不得保存过久,一般在3 天内用完。
(4)亚碲酸钾蛋白胨水及亚碲酸钾琼脂平板成分及制法:
① 可溶性淀粉0.5克
蒸馏水10 毫升
将可溶性淀粉溶于蒸馏水混合,煮沸2 分钟(待淀粉透明即可).
② 牛肉膏0.3-0.5克蛋白胨1 克
KNO3 0.1克
MgCl2 0.1克
NaCl  1 克
蒸馏水9O 毫升
③ 0.2%亚碲酸钾水溶液,用赛氏滤菌器过滤,或阿诺德氏灭菌器加热100℃ 30 分钟.
④ 制法;将② 中诸物混和加热至全部溶解,将① 全部加入,待冷至50-60℃ ,滴定pH 为9.2, (用0.04%溴麝香草酚蓝作指示剂),分装于三角瓶中每瓶100 毫升,112.6℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。使用前每100毫升加入已灭菌的0.2%亚碲酸钾水溶液1 毫升及0.5%蔷薇酸酒精溶液l 毫升,混合后以无菌操作技术分装于无菌试管中,每管5-10 毫升.
如果制备固体培养基时,可在② 液内加2-3 %琼脂,其他各步与上述相同,最后倾入平皿,制成平板培养基.
2 .增菌培养
取水样900 毫升加到内含5%氯化钠和10%碱性质白胨水的无菌混合液100 毫升(pH9.0)于37 ℃ 下培养24 小时。或取水样1-2升,在赛氏滤器上过滤,将其滤纸放于碱性蛋白水溶液、或放于雪氏蛋白胨水中作增菌培养24 小时.
3 .分离培养
取少量的增菌培养液在阿伦森氏平板培养基上涂布接种.于37 ℃ 下培养12-24 小时。霍乱弧菌的菌落呈鲜红色,大肠杆菌群的菌落较小呈淡红色。
如果将增菌液涂布于亚蹄酸钾琼脂平板.在37 ℃ 下培养8-12 小时,由于其中蔷薇酸抑制革兰氏阳性细菌.亚碲酸钾抑制其他革兰氏阴性菌生长,仅霍乱弧菌能还原亚碲酸钾,形成黑色菌落。因此,这种培养基更适合于分离霍乱弧菌。
4 .镜检
挑取典型菌落制片.染色镜检和悬滴镜检,若为革兰氏阴性,运动活泼的弧菌,则可初步确定所分离的是霍乱弧菌。
5 .生理生化检验
根据霍乱弧菌的生理生化特征可分为四个生物类型,进行生理生化试验时可按2-8 的项目进行。
表2-8 霍乱弧菌四个生物型的特征区别
检验项目
生物型
 
 
 
 
霍乱型
埃尔托型
变形型
白色型
鞭毛数
1
1
1
1或多
溶血作用(管内)
-
d
+
-
甘露糖发酵
+
+
+
-
阿拉伯糖发酵
-
-
-
-
蔗糖发酵
+
+
+
+
V.P.于22℃
-
+
d
+
V.P.于37℃
d
+
d
+
M.R.于22℃
+
d
d
-
M.R.于37℃
+
+
d
d
硝酸盐还原到硝酸盐
+
+
-
+
吲哚产生(22℃)
+
+
-
(+)o
吲哚产生(37℃)
d
d
(+)o
-
赖氨酸脱羧反应
+
+
-
+
37℃生长
+
+
+
+
5℃生长
-
-
+
-
42℃生长
d
d
-
-
在0%氯化钠生长
+
+
-
+
在4%氯化钠生长
+
+
+
+
在7%氯化钠生长
d
d
+
-
在8%氯化钠生长
-
-
(+)o
-
pH为10生长
+
+
+
+
pH为11生长
d
d
+
-
霍乱红反应
+
+
-
-
发光
-
-
-
+
注:d多种生化反应,(+)o为迟缓反应。+阳性反应,-阴性反应

 

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