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《水生微生物实验法》——滤膜法分离检验水中大肠杆菌群



录入时间:2010-9-10 15:37:43 来源:青岛海博

 

(十八)滤膜法分离检验水中大肠杆菌群

人们在检查病原菌污染的饮用水、近海海水和水源水时,经常以检查水中大肠杆菌的数量作为指标(我国《生活饮用水卫生标准》 规定:每升水中大肠杆菌不多于3 个,可作为饮用水。)来说明水受人畜粪便污染的程度。因水中由病人和病畜或带菌者的粪便污染而来的病原菌数量很少.不易直接检查,而水中的大肠杆菌群,如果超过一定数量.就说明被检查水可能有病菌存在。实际上这种检查过程,首先是应用选择性培养基,将大肠杆菌群从杂菌中分离出来的一种过程。

其检验方法有两种:一是发酵法,即根据大肠杆菌群具有能分解乳糖生成CO2等气体的特性酶,而其他肠道细菌如志贺氏菌属、沙门氏菌属,由于没有这种特性酶,不能产气,可被区别开来。另一种是滤膜法,它是利用细菌不能通过微孔性薄膜.在抽滤下液体滤过而细菌被截留在膜上.然后用具有高度选择性的品红亚硫酸钠培养基(远滕氏培养基)分离培养,本实验将应用这种方法分离鉴定大肠杆菌群.此法较简单而快速,发酵法较之繁杂,所需的时间也较长。

1 .培养基的成分及制备

1)品红亚硫酸钠培养基:

蛋白胨10

牛肉膏5

酵母浸膏5

乳糖10

琼脂20

K2HPO4 3.5

无水Na2SO3 5 左右

5 %硷性品红乙醇溶液20毫升

蒸馏水1000毫升

2)储备培养基的制备:

① 将琼脂加于800毫升蒸馏水中,加热溶解后,加磷酸氢二钾、蛋白胨、牛肉膏及酵母浸膏,混匀,溶解,以蒸馏水补足1000毫升、调pH 7.2-7.4 。

 ② 趁热用脱脂棉或绒布过滤后加入乳糖,混匀后定量分装于锥形瓶中。包装后于115 蒸汽下灭菌20 分钟,存于冷暗处备用。

3)平板培养基的制备:

① 加热溶化上述配制的储备培养基。

② 据瓶内培养的数量按2%的比例吸5%硷性品红乙醇溶液注入无菌试管中.

③ 同样按比例(5‰)称无水亚硫酸纳置于灭菌的另一空试管中煮沸10分钟灭菌后,例入硷性品红乙醇液中混合后,全液加到以融化的储备培养基内,充分混匀(防止产生气泡)。

④ 立即将此液分装于无菌培养皿中,制成平板培养基,冷凝后置于冰箱内备用,但不宜存过久。此种培养基专供滤膜法测定大肠杆菌群时用。据使用情况,培养基中硷性品红用最也可适当减少。

4)乳糖蛋白胨半固体培养基成分及制法:

蛋白胨10

牛肉膏5

酵母浸膏5

乳糖10

琼脂5 左右

蒸馏水1000毫升

将上面各成分放于水中加热溶解混匀,调pH 7.2-7.4 ,过滤,分装于小试管内,置高压蒸汽锅内,115下灭菌20分钟,冷后放冰箱内保存。但存放不宜超过两周。此培养基制成后.常用已知的大肠杆菌释菌株作鉴定.应在6 -8 小时后产生明显的气泡.

2 .滤膜与滤器的灭菌

1)将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水, 于沸水溶中煮沸灭菌三次.每次15 分钟。前二次煮沸后需换水洗涤2-3 次,以除去残留的溶剂。

2)滤器灭菌,用点燃的酒精棉球火焰灭菌,也可用纱布和牛皮纸包装好于121 蒸汽下,高压灭菌20 分钟

3 .分离培养

1)过滤水样(海水、饮用水、自来水,水库水及各种水源水),用灭菌镊子夹取灭菌滤膜边缘,使粗糙面向上,贴放于已灭菌的滤器上,稳妥地固定好滤器,将水样注入滤器内,加盖,打开滤器阀门.在负0.4 大气压下抽滤,水样抽完后,再抽气5 秒钟,关上滤器阀门,取下滤器。

2)用灭菌摄于夹滤膜边缘,移放在平板培养基上,使滤膜的截留细菌面向上,另一面完全紧贴培养基,两者之何不得留有气泡,重复以上的步骤,再接种一、二个平板.倒置培养皿于37下培养20-24 小时。

3)观察。挑选符合下列特征的菌落涂片,革兰氏染色镜检。

紫红色,具有金属光泽的菌落.

深红色,不带或略带金属光泽的菌落,

淡红色,中央色较深的菌落。

④ 凡属革兰氏染色阴性、无芽孢杆菌,应将其穿刺接种于乳糖蛋白胨半固体培养基(接种前须将此培养基放在水溶中煮沸排气,待冷凝后使用),经37培养6-8 小时,若沿刺种线有气泡产生者,则可判定为所分离检验的细菌群是大肠杆菌群。

5)含量(污染程度)的计算:1 毫升水样中的大肠杆菌群数等于滤膜上生长的大肠杆菌群的菌落平均数乘以稀释倍数.最后除以样品的毫升数,即得。

 

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