（十八）滤膜法分离检验水中大肠杆菌群

人们在检查病原菌污染的饮用水、近海海水和水源水时，经常以检查水中大肠杆菌的数量作为指标（我国《生活饮用水卫生标准》 规定：每升水中大肠杆菌不多于3 个，可作为饮用水。）来说明水受人畜粪便污染的程度。因水中由病人和病畜或带菌者的粪便污染而来的病原菌数量很少．不易直接检查，而水中的大肠杆菌群，如果超过一定数量．就说明被检查水可能有病菌存在。实际上这种检查过程，首先是应用选择性培养基，将大肠杆菌群从杂菌中分离出来的一种过程。

其检验方法有两种：一是发酵法，即根据大肠杆菌群具有能分解乳糖生成CO₂等气体的特性酶，而其他肠道细菌如志贺氏菌属、沙门氏菌属，由于没有这种特性酶，不能产气，可被区别开来。另一种是滤膜法，它是利用细菌不能通过微孔性薄膜．在抽滤下液体滤过而细菌被截留在膜上．然后用具有高度选择性的品红亚硫酸钠培养基（远滕氏培养基）分离培养，本实验将应用这种方法分离鉴定大肠杆菌群．此法较简单而快速，发酵法较之繁杂，所需的时间也较长。

1 ．培养基的成分及制备

（1）品红亚硫酸钠培养基：

蛋白胨10克

牛肉膏5 克

酵母浸膏5 克

乳糖10克

琼脂20克

K₂HPO₄ 3.5克

无水Na₂SO₃ 5 克左右

5 %硷性品红乙醇溶液20毫升

蒸馏水1000毫升

（2）储备培养基的制备：

① 将琼脂加于800毫升蒸馏水中，加热溶解后，加磷酸氢二钾、蛋白胨、牛肉膏及酵母浸膏，混匀，溶解，以蒸馏水补足1000毫升、调pH 为7.2-7.4 。

 ② 趁热用脱脂棉或绒布过滤后加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶中。包装后于115℃ 蒸汽下灭菌20 分钟，存于冷暗处备用。

（3）平板培养基的制备：

① 加热溶化上述配制的储备培养基。

② 据瓶内培养的数量按2%的比例吸5%硷性品红乙醇溶液注入无菌试管中．

③ 同样按比例（5‰）称无水亚硫酸纳置于灭菌的另一空试管中煮沸10分钟灭菌后，例入硷性品红乙醇液中混合后，全液加到以融化的储备培养基内，充分混匀（防止产生气泡）。

④ 立即将此液分装于无菌培养皿中，制成平板培养基，冷凝后置于冰箱内备用，但不宜存过久。此种培养基专供滤膜法测定大肠杆菌群时用。据使用情况，培养基中硷性品红用最也可适当减少。

（4）乳糖蛋白胨半固体培养基成分及制法：

蛋白胨10 克

牛肉膏5 克

酵母浸膏5 克

乳糖10 克

琼脂5 克左右

蒸馏水1000毫升

将上面各成分放于水中加热溶解混匀，调pH 为7.2-7.4 ，过滤，分装于小试管内，置高压蒸汽锅内，115℃下灭菌20分钟，冷后放冰箱内保存。但存放不宜超过两周。此培养基制成后．常用已知的大肠杆菌释菌株作鉴定．应在6 -8 小时后产生明显的气泡．

2 ．滤膜与滤器的灭菌

（1）将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水， 于沸水溶中煮沸灭菌三次．每次15 分钟。前二次煮沸后需换水洗涤2-3 次，以除去残留的溶剂。

（2）滤器灭菌，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用纱布和牛皮纸包装好于121℃ 蒸汽下，高压灭菌20 分钟

3 ．分离培养

（1）过滤水样（海水、饮用水、自来水，水库水及各种水源水），用灭菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，使粗糙面向上，贴放于已灭菌的滤器上，稳妥地固定好滤器，将水样注入滤器内，加盖，打开滤器阀门．在负0.4 大气压下抽滤，水样抽完后，再抽气5 秒钟，关上滤器阀门，取下滤器。

（2）用灭菌摄于夹滤膜边缘，移放在平板培养基上，使滤膜的截留细菌面向上，另一面完全紧贴培养基，两者之何不得留有气泡，重复以上的步骤，再接种一、二个平板．倒置培养皿于37℃下培养20-24 小时。

（3）观察。挑选符合下列特征的菌落涂片，革兰氏染色镜检。

紫红色，具有金属光泽的菌落．

深红色，不带或略带金属光泽的菌落，

淡红色，中央色较深的菌落。

④ 凡属革兰氏染色阴性、无芽孢杆菌，应将其穿刺接种于乳糖蛋白胨半固体培养基（接种前须将此培养基放在水溶中煮沸排气，待冷凝后使用），经37℃培养6-8 小时，若沿刺种线有气泡产生者，则可判定为所分离检验的细菌群是大肠杆菌群。

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