（十三）铁细菌富集分离及形态观察

能接触性地加速重碳酸亚铁〔 Fe ( HCO3）2〕 溶液中的Fe2+氧化成Fe3+,从而引起氢氧化铁沉淀产生的细菌叫做铁细菌。它们不但存在于含铁的泉水、沼泽地、湖泊和流水缓慢的河床和水稻田中，而且生存在海底淤泥、海水和湖中，如赭色丝细菌（赭色纤发菌）、多孢泉发菌（多孢铁细菌）、含铁嘉氏铁柄杆菌（铁锈色披毛菌）、丝藻铁单胞菌（丝藻链球铁细菌）等。

1.铁细菌的增菌培养

（1）增菌培养基成分及其配制：

① 海水稻草浸出液，取稻草少量加海水煮沸，去稻草，取上清液加海水调成浅黄色即成．

② 稻草增菌培养液：

稻草浸出液  90毫升

铁片1 小块（或小铁钉l 支）

稻草浸出液于121 ℃ 蒸汽下灭菌20分钟，将铁片或小铁钉包好置160 ℃ 干热灭菌60 分钟，待冷后放入浸出液中即成。

③ Winogradsky 铁细菌培养液。

NH₄NO₃    0.5克

NaNO₃  0.5克

K₂HPO₄   0.5克

MgSO₄·7H₂O   0.5克

CaCl₂·6H₂O  0.2克

柠檬酸铁铵  10克

水1000 毫升

分装于烧瓶中，每瓶50 毫升，121 ℃ 蒸汽灭菌20 分钟。如果在灭菌前加琼脂15 克．可作为固体培养基。

（2）接种培养与镜检：取含有机酸表层海泥各l 克，分别接种于上面两种增菌液中．培养瓶塞紧，放于暗处，18-20℃ 下，培养2-10 天，如有松软的灰色絮花出现，而后转变为赭黄色时，将其挑取少许制成水浸片，在显微镜下观察，可见到赭色纤发菌和含铁嘉氏铁柄杆菌等．取下玻片，在盖玻片的一边加2%K₃Fe（CN）₆。和10%盐酸各1 小滴，从另一边，用吸水纸吸去多余水分，再置于显微镜下观察其形态．若菌丝或粘液变为蓝色，证明有铁的沉淀物．即三价铁与黄血盐作用形成普鲁氏蓝，所镜检的细菌为铁细菌．

 2 ．铁细菌的分离与纯化

（1）培养基的成分及其配制．

① 亚铁杆菌属液体培养基：

a ．无机培养液：

( NH₄ )₂SO₄   0.15克

KCl    0.05克

MgSO₄·7H₂O   0.50克

K₂HPO₄   0.05克

Ca ( NO₃）₂   0.01克

蒸馏水   1000毫升

把以上盐类溶于蒸馏水中，分装于烧瓶，每瓶90毫升，于121 ℃ 蒸汽下灭菌15 分钟，即无机培养液。

b ．母液    

FeSO₄·7H₂O   10 克加蒸馏水至100 毫升，过滤除菌即成。

c ．液体培养基   

每90 毫升无机培养液加10 毫升母液，摇匀，最后为乳白色的混合液．冷藏不致氧化，备用。

② 亚铁杆菌固体培养基：

a.无机培养液

( NH₄ )₂SO₄   6.0克

KCl    0.05克

MgSO₄·7H₂O   0.50克

Ca ( NO₃）₂   0.01克

蒸馏水   250毫升

将以上无机盐溶于蒸馏水中，分装于125 毫升的锥形瓶中，每瓶25 毫升，于121℃ 蒸汽下灭菌15 分钟，备用。

b ．缓冲液：溶13 .5 克磷酸氢二钾于100 毫升蒸馏水中，单独灭菌待用。

c.硫酸亚铁溶液：制法同液体培养基母液。

d ．硅酸溶胶：用蒸馏水将浓盐酸（比重1.19）的比重调至1.10 （每100 毫升浓盐酸大约须加蒸馏水100毫升）。另以蒸馏水把市售的水玻璃的比重调到1.06-1.08，取等量的两液，将后液倾入前液，不得反之。两液充分混匀后，用盐酸调pH 为2，分装于试管和烧瓶，于110 ℃ 下灭菌25 分钟，烧瓶中培养基倾注成平板，试管的摆成斜面（或立即倒入直径10厘米的培养皿，每皿30 毫升，静置1 天凝成平板）。

e．固体培养基：取1 毫升硫酸亚铁溶液于75 毫升硅酸溶胶中，另取l 毫升无菌磷酸缓冲液加入25 毫升的无菌盐溶液中，混合此二液．摇匀后倾注成平板，静置24 小时使其凝胶化。

若预先把硅酸溶胶在平皿上凝固成平板．则把其他三种溶液混匀后，取混合液2 毫升均匀地分布在硅酸胶平板上，在50 ℃ 下烘至平板上无水流动。不宜过干，以免平板破裂。为保持培养基潮湿，可在皿盖上放一张湿滤纸．

③ 嘉氏铁柄杆菌的无机培养液．

( NH₄ )₂SO₄   1.5克

KCl    0.05克

MgSO₄·7H₂O   0.05克

K₂HPO₄   0.05克

Ca ( NO₃）₂   0.01克

蒸馏水   1000毫升

 将以上的无机盐溶于蒸馏水中，调pH 为6.0，分装于100 毫升的三角烧瓶中，每瓶装2 厘米高．121 ℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。冷后加入预先封闭在试管中、单独以160 ℃ 干热灭菌1 小时的大粒软铁屑0.05克．为使生长良好，可加无菌的重碳酸铁〔 Fe（HCO₃）₂〕 1%量，即可接种。

④ 嘉氏铁柄杆菌固体培养基：配制法基本上同亚铁固体培养基。只是把液体培养基中的（NH₄）₂SO₄改为6 克，将FeSO₄·7H₂O母液换成Fe ( HCO₃ )₂母液，其他配方及方法均相同。

⑤ 缠绕纤发菌液体培养基：

KNO₃     1 克

K₂HPO₄   0.1克

MgSO₄   0.1克

FeSO₄   0.01克

蒸馏水1000毫升

将4 种无机盐按顺序溶于蒸馏水中，调pH 为6，分装于100 毫升的烧瓶中，每瓶液高约2 厘米。于121℃ 蒸汽中．灭菌20 分钟。

⑥ 缠绕纤发菌固体培养基：

a .无机培养液    即用其液体培养基。

b . 母液   用1%硫酸亚铁溶液．

c .缓冲液    同分离亚铁杆菌的缓冲液。

d ．硅酸溶胶    同分离亚铁杆菌的硅酸盐溶胶。但凋pH为6。

e ．固体培养基   各液的比例及配法同上述。

（2）接种分离培养：取增菌中的菌浓或待测样品（海泥或海水）少许．分别接种于上述各种培养液中，并各做无接种的对照瓶，一起放于同样条件下培养．嘉氏铁柄杆菌置于6 ℃ 下培养。缠绕纤发菌于8 ℃ 中培养，亚铁杆菌置于10 ℃ 左右培养．均至有明显生长为止．

① 平面分离：取液体培养物涂抹于相应的平面上，置于适温下培养至长出明显菌落。观察菌落形态，并做镜检。

② 纯培养：挑取单个菌落中央菌苔，于斜面划线，在适温下培养，长出后放于-5 ℃ 以下的冰箱中保存。备用。

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