（九）磷细菌的分离

磷细菌是将海水、淡水和土壤中的无效磷转化为有效磷的细菌并可分为两个类型．一是促使含磷有机物分解，释放出能被动物利用的磷．即有效磷，称为有机磷细菌．另一类是能促使不溶性无机磷转化为可溶性磷的细菌，称为无机磷细菌，此类细菌能产生具有溶解不溶性磷酸钙的酸性物质。

1 ．有机磷细菌的分离

（1）平板培养基制备：

① 蒙金娜基础培养基成分及制法

葡萄糖     10.0克

( NH4）2SO4   0.5克

MgSO4·7H2O    0.3 克

NaCl 0.3 克

KCl   0.3 克

FeSO4·7H2O    0.036 克（0.5%溶液6 毫升）

MnSO4 0.03 克（0.5%溶液6 毫升）

CaCO3   5 克

琼脂    18-20 克

将这些成分溶于蒸馏水中，加热溶化，混匀，加至1000毫升后分装于150 毫升锥形瓶中、包装好，于121 ℃ 蒸气下灭菌20-30 分钟，备用。

② 卵黄稀释液制法：本液须在制平板前临时制备．用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，用解剖刀切破鸡蛋两端，流去蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中，约加等量的无菌水）摇匀即成。

③ 将蒙金娜基础培养基融化，冷至50℃ 后，立即再加入卵黄液，每12-15 毫升的基础培养基加卵黄稀释液1 毫升作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板．

（2）各取两个不同站位的海粘泥和河口粘泥各5 克，分别溶于装有45 毫升无菌水及若干玻璃球的锥形瓶内，摇匀，各取上清液l 毫升分别注入装有9毫升无菌水的试管中，即冲稀10 倍。

（3）用接种环取1 环悬液接种于平板培养基上，用曲-玻棒涂匀，每种悬液接种2 个平板（即每种样品作4 个平板）, 颠倒8 个平板在25-30 ℃ 下培养1-2 天，

（4）观察菌落形态，由于有机磷细菌能分解卵黄中的有机磷产生磷酸，故在其菌落的周围可形成一个碳酸钙溶解区。若未得到纯菌落，则挑选菌苔少许，用稀释液在平板培养基上分离，直到纯化后，再移接到牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3 克，蛋白胨5 克，琼脂15 克，水1000 毫升。pH7.2-7.4）斜面上保存．

2 ．无机磷细菌的分离

(1)分离培养基的制备：用2 克的磷酸钙代替蒙金娜基础培养基中的碳酸钙成分即可配成。

(2)取样、接种、培养均按上述有机磷细菌的方法进行，

(3)观察菌落的形态：因为有磷酸钙粉末的存在，制成的培养基不透明，因而接种后若能使磷酸钙溶解的细菌，在其菌落周围就会出现透明区．据此可知分离的细菌为无机磷细菌，可挑取其菌落作为纯化培养，纯化后接种斜面培养基上保存。

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