（六）反硝化细菌的富集培养与分离

反硝化细菌的种类很多。它们主要属于革兰氏染色负反应，不生芽孢的杆菌，并都属兼、嫌气性细菌，在通气不良的情况下，可完全利用硝酸盐或亚硝酸盐中的氧来氧化所需的有机物。即对硝酸盐和亚硝酸盐起反硝化作用也就是对它们起还原作用。

1 ．反硝化细菌富集培养

（1）培养基成分及其制备：

KNO₃    2克

柠檬酸钠5 克

K₂HPO₄ 1 克

KH₂PO₄ 1 克

MgSO₄·7H₂O  0.2 克

陈海水（或蒸馏水）1000 毫升

将上面成分溶解于水，调pH 为7.2-7.6，分装于试管或烧瓶．于121 ℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。

（2）接种与结果观察：在装富集培养液的试管中分别加少量的海泥或池泥．河泥，在20℃ 或25-30℃ 下培养5-15 天或3-10天。若培养液变混浊，有气泡产生，说明有反硝化菌生长，或检验其有无氨和亚硝酸产生，则可判定是否有反硝化细菌生长．

2 ．分离培养

（1）分离培养基成分及制备．

葡萄糖1克

酒石酸钾钠10 克

KNO₃  2 克

K₂HPO₄   0.2克

CaCl·2H₂O   0.5 克

陈海水或蒸馏水1000毫升

将上述盐类溶于水中，调pH 为7.4-7.6，装于烧瓶中，121℃ 蒸汽下灭菌20 分钟．

（2）接种与结果观察：

① 将上述培养液倾入硅酸胶平板上，于50 ℃ 下烘烤至表面无水流动，不宜过干，以免破裂．

② 用富集培养物涂布接种于烘烤后的平板培养基上。

③ 于适温厌氧条件下培养至长出足够大的菌落．

④ 观察菌落形态，作革兰氏染色，油镜下观察其反应及菌体形态．

⑤ 挑取菌落于液体培养基上培养，检验其培养基中有无硝酸盐（用二苯胺试剂检验）和亚硝酸盐（用锌-碘-淀粉或格里斯试剂检查，见硝化细菌的富集与分离）存在，若硝酸根或亚硝酸根消失，可确定所分离细菌属反硝化细菌．

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