（五）硝化细菌的富集培养和分离

海洋、港湾、湖泊中的腐生细菌可以把动植物体分解成为氨或氨基酸，固氮菌等可将游离氮变成氨。而生长在水环境中的硝化细菌却能把氨或氨基酸转化为硝酸盐．如此生成的硝酸盐，正好是浮游植物必要吸收的有机营养物．氨在微生物作用下氧化成硝酸盐有两个过程，一是在亚硝化单胞菌属等一类亚硝化菌的作用下，使氨氧化成亚硝酸盐的过程．是一种放热反应，这个反应降低了热力电势，在25 ℃ 下放出59400卡克^-1热量；另一过程是由硝化杆菌属等氧化亚硝酸盐成硝酸盐，并放出18000卡克^-1热量：

 1 ．亚硝化细菌的富集培养

( l ）富集培养基配制．

( NH₄ )₂SO₄   0.2克K

K₂HPO₄    0.1克

MgSO₄   0.05 克

NaCl  0.2克

FeSO₄  0.04 克

CaCO₃或MgCO₃  0.5克

水100 毫升

pH 7.2

除CaCO₃或MgCO₃外，将其他成分溶解于水中，分装入锥形瓶，视瓶容量，每瓶装30-50毫升，液层厚约1厘米左右即可，而后按0.5%比例加入CaCO₃或MgCO₃．塞上棉塞，包装好，在121 ℃ 蒸汽下灭菌2O 分钟备用。

（2）用取样器取近岸的富有机质的软海泥及污池泥或污沟软泥各1 份．各取少许泥样接种于锥形瓶中混匀。每个样品接种2 瓶，置20 ℃下培养7-10 天。

（3） NO₂^- 压的测定．在白色比色板的凹窝内加3 滴锌-碘-淀粉液，滴入20%的硫酸，加培养液2 滴，如有NO₂^-存在立即出现蓝色．这证明培养基中的NH₄⁺ 经亚硝化细菌作用已转化成为NO₂^- ，即有亚硝化细菌存在。也可用奈氏试剂检查有无氨态氮存在。若没有氨态氮存在，说明NH₄⁺ 已被氧化为NO₂^- ，这也证明了亚硝化细菌的存在．另用未接种培养基作对照。若以陈海水为培养基的溶液时，由于海水含有NO₂^-  ，对照管也呈NO₂^- 阳性反应．这时可延长培养时间，检查NH₄⁺ 的消失，但应注意实验室的空气中常常有氨态氮的存在。

（4）当所有的氨被氧化后，在培养液中加1 毫升10%的( NH₄ )₂SO₄   ，如此重复几次．直到培养液中的亚硝化细菌很多为止。

2 ．亚硝化细菌的分离与纯化

（1）硅酸胶平板培养基的制法：用蒸馏水（约50 毫升）将比重为1.19的50 毫升浓盐酸调到1.10，再用蒸馏水将市售的水玻璃的比重调到1.06-1.08 ．将调好的水玻璃100 毫升倒入上液（不得反过来倒）．两液混匀后立即分装于直径10 厘米的培养皿内，每皿装30 毫升，倒6 个平板。静置1 天，凝成平板后．用缓慢的流水漂洗3 天．至氯离子完全消失。用无菌水淋洗两次，倾去多余的水分即成硅酸胶平板．

将上述采用的培养基成分用量的一半加入20 毫升蒸馏水中溶解灭菌．每个硅酸胶平板加2 毫升此种培养液，轻轻转动培养皿，使培养液分布均匀。打开皿盖，在50 ℃ 下烘至平板表面没有流动水为止（过干会使硅胶平板破裂）。

（2）取富有机质的近岸海泥，污池软泥和污沟软泥样各少许点种于平板表面，三种样品各点种2个平板。为保持平板的水分，可在皿盖上放一张湿滤纸或将培养皿放在28-30℃ 的湿室内培养15-30 天。由于硅酸胶平板有高度的选择性，在点样周围长出的都是亚硝化细菌。可挑此菌落于斜面培养待用。

3 ．硝化细菌的富集培养

自然界中除自养菌能进行硝化作用外，近年来也报道了很多异养菌的硝化作用。许多异养菌能在含按盐的培养基中产生微量的亚硝酸。而某些真菌还能在培养基中氧化亚硝酸。即此二类微生物在一起能把铵转化为硝酸。

① 富集培养基的制备．

NaNO3  1 克

Na2CO3（无水）1 克

NaCl   0.5 克

K2HPO4   0.5 克

MgSO4   0.5克

FeSO4  0.4 克将这些药品溶于1000毫升水中．分装于1000毫升的锥形瓶中，于121 ℃ 蒸汽下灭菌20 分钟，备用。

（2）用3 个取样器分别取近岸有机质半富的海泥、河口软泥、污池泥。

（3）三种样品各取少量，分别接种于培养基中混匀，在20-25 ℃ 下培养5-7 天．

（4）根据亚硝酸盐的消失，硝酸盐的形成，可验证细菌硝化作用过程第二阶段的存在。亚硝酸盐的消失可用格里斯（Griess ）试剂或锌-碘-淀粉溶液测定．用后者测定见前述，用前者测定，即加格里斯试剂（也称亚硝酸试剂）甲、乙液各2 滴于白瓷盘的凹窝，再加待测的培养液l 滴，如果亚硝酸盐被氧化完毕，则颜色不变，证明了硝化细菌的存在。也可将新鲜（无接种）的培养液作对照，这时未接种培养液反应为红色，即有亚硝酸盐的存在。

硝酸盐的测定，即在白瓷凹窝中加浓硫酸和二苯胺试剂各2 滴，如出现蓝色说明亚硝酸盐培养基在硝化细菌的作用下，已被氧化成硝酸盐．另外用未接种培养基作对照．

（5）培养液中的亚硝酸盐被氧化完全后，加入10%亚稍酸钠溶液5 毫升，重复几次上述的实验后，可获得富集硝化细菌的培养液。

4 ．硝化细菌的分离纯化

( 1 ）试验步骤如下：

① 利用前述富集培养基配方加入1.5-2%琼脂，制成固体平板培养基．

② 取上述三种样品各5 克，分别加入5 毫升无菌水（海水样品用无菌海水）中．摇匀，各取上清液0.1毫升接种于平板上，每种样品各接种2 份，或用硅酸胶平板分离（见亚硝化细菌分离）。分离的菌落可接种于斜面培养基上培养，待用。

（2）试剂配制：

① 锌-碘-淀粉试剂的配法：将25克氯化锌溶于25 毫升蒸馏水中，l 克淀粉溶于少量水，两液混合煮沸至淀粉溶解后，加入0.5 克碘化锌，蒸馏水加至250 毫升即成（制成的溶液应是无色的）．保存于棕色瓶中待用。

② 奈氏（Nessler ）试剂的配制法，奈氏试剂（也称氨试剂）为碘化汞与碘化钾复盐（HgI·2KI ）的碱性溶液，其配法有多种，现介绍一种如下；

a ．甲液:碘化钾10 克、蒸馏水100 毫升、碘化汞20 克。

b ．乙液：氢氧化钾20 克、蒸馏水100 毫升。

分别按上列配方制备甲、乙两液。待冷后．将两液混合保存于暗色瓶中备用。为加速溶解，碘化汞可预先放在研钵中加几滴碘化钾研碎．

③ 格里斯（Griess ）试剂配制：其配方有几种，现介绍常用的一种：

a ．甲液：对氨基苯磺酸（即磺胺酸）0.8 克、5N 醋酸( 1 份冰醋酸加2.5 份水）100 毫升，配时不能加热溶解．

b ．乙液：α-奈胺0.5 克、5N 醋酸100 毫升．加热溶解。

同时把甲、乙两液等量混合，但混合液不能较长时间保存。

④ 二苯胺试剂配法；二苯胺1.0克溶在20 毫升蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸100 毫升即成，保存在棕色瓶中备用。

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