第二章水生微生物的分离与纯化

    在海洋、湖泊、河流、池塘和饮用水中微生物都混杂地生长或生存着，要研究某一微生物，必须把它从混杂的微生物类群中分离出来，这种过程称为“分离”。微生物学中把一个细胞通过分裂得到后代的过程叫做纯化培养。微生物分离与纯化的方法很多，可分为稀释倒平板（平皿）法，划线法单细胞挑取分离法和培养条件控制法等。后者包括．选择培养基分离法。好氧与厌氧培养分离法和pH 、温度等控制分离法。

    应用上述方法使细菌单个细胞或同一类细胞在培养基上长出菌落，而后根据菌落及菌体的形态特征挑取所需单个菌落的菌苔少许，接种于斜面培养基中培养，然后再从斜面培养基的菌苔挑出分离（或直接从单菌落中挑出），反复数次直到生长的菌落形态一致及其菌体形态也一致为止，则可提供生理生化鉴定、研究。

 

一、培养基的配制

 

（一）培养基配制的基本原理

      由于科学研究或生产需要，人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质及其生活环境叫培养基．各种微生物对营养的要求各不相同。尽管当前培养基配方多至数千种，但为进一步研究微生物和提高生产，特别是寻找或发现新种时，现有培养基配方不一定是最适用的，甚至是不适用的。譬如：目前尚未找出一种培养基能满足海泥或海水样品中所有的微生物生长的需要。因此，在学会配制培养基的同时应掌握关于培养基配方设计的基本原则。

 

1 ．选择适宜的营养物质

 

( 1 ）碳源：它是构成微生物细胞及其代谢产物碳架的营养基质和提供能量的来源。碳源可分为有机和无机两大类。培养自养微生物时、一般挑选无机碳化合物作为碳源，而培养异养微生物时则用有机碳，即碳水化合物，碳氢化合物等。

 

( 2 ）氮源：它是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的基本营养物质，也可分为无机和有机氮源两大类。主要是作为微生物细胞合成原生质和细胞其他结构的原料。一般不作能量的提供者。培养有固氮能力的固氮细菌，部分光合细菌和蓝藻用分子氮．即气态氮（空气），培养酵母菌、霉菌，放线菌和许多腐生细菌及动植物的病原菌．多选用铵盐或硝酸盐作氮源，也可利用某些有机氮化合物为氮源。如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、鱼粉、黄豆饼粉、玉米浆等。

 

( 3 ）无机盐：其主要功能是构成细胞和酶组成部分，维持酶的活性．调节微生物细胞的渗透压，氢离子浓度，氧化还原电位等，配制一般微生物培养基时采用硫酸盐、磷酸盐和含钾，钠、镁、铁、氮等元素的化合物．培养硫细菌时，应适当增加硫的用量。培养海洋微生物时，则要增加氯化钠含量，或以陈海水代替蒸馏水等。

 

( 4 ）微量元素：如钼、锌、锰、钴、镍、铜、碘、溴、钒等。主要功能是作为酶蛋白成分之一，能活化酶。它们的存在与否，往往能非常强烈地影响微生物的生命活动。微生物对其需要量极微，在培养基中一般仅含0.1ppm就能满足，多了反而会使微生物中毒。这些微量元素常常混在其他营养物质和水中，所以配制培养基时，通常不需另加效量元素。

 

( 5 ）生长素：包括维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶三类物质，是维持微生物正常生活不可缺少的、需要量不大的特殊有机物。大多数维生素是辅酶的组成结构，嘌呤和嘧啶的主要功能是构成核酸和辅酶．很多异养微生物和所有自养微生物本身都能合成所需的生长素，均不必在其培养其中另加现成的生长素。缺陷型的变异菌株则需要在基本培养基中附加适量相应的生长素才能生长得好。常用作生长素的物质有酵母膏、玉米浆、肝浸液等。许多作为碳、氮源的天然成分，如麦芽汁，土豆汁，牛肉膏、麸皮、米糠等皆含有丰富的生长素，在含有此类物质的培养基中就无需加生长素。

 

( 6 ）水：微生物细胞内含有大量的水分（约75-85％）, 它既直接参加微生物的代谢过程，又是代谢反应的介质。水的比热高，有利于调节微生物细胞的温度。所以水在微生物细胞中的功能是多方面的。海水、自来水，河水等均可用于培养基的配制，但当水中的矿物质含量过多时必须经过软化后才能采用．配制合成培养基时应采用蒸馏水或无离子水。培养海洋微生物或其稀释液时需用陈海水。

 

( 7 ）凝固剂：有琼脂（洋菜）、明胶（动物胶）及硅胶（水玻璃）等。制备固体或半固体培养基时皆需加入上述凝固剂中的一种。琼脂性能稳定不被大多数微生物液化、分解、利用．对大多数微生物无害，不因灭菌而受破坏，40 ℃ 时凝固，96 ℃ 能完全熔化，透明度、粘度皆好，故制平板、斜面或半固体培养基时均使用它。而明胶的熔点低（25 ℃ ）, 能被多种微生物水解利用，故仅在鉴定微生物时使用它。硅胶与盐酸及硫酸中和时凝成胶体，适用于分离自养微生物如硝化细菌，亚硝化细菌等。

 

2．确定各种营养物质的用量

在设计配制培养基方案中除选择各种营养物质外，还必须确定所需营养物质的用量及其量的比例。这应根据所培养的微生物在整个代谢过程中的需要和培养目的而定，以适量为宜，既不妨碍微生物正常生长和培养的目的，又不致于造成浪费。培养基中水溶性的物质用量过多，浓度过高、渗透压也就过高，则会阻碍微生物的吸收利用，并抑制其生长。微生物如将一份氮化合物作为自身细胞物质时．约需四份碳化合物作能源。因此一般来说，碳源的用量最大。氮的用量次之。碳氮用量之比，因微上物的种类而异，培养细菌和酵母菌的碳氮比约为5 : 1 ，霉菌约10:1 。一般碳源约占培养基的百分之几，氮源占千分之几．无机盐中磷、钾用量约为0.07%，镁、硫约为0.02%，各种维生素用量稍大，每升中约合若干毫克。

 

3 ．调配和控制适宜的酸碱度

    各类微生物因其生理功能的差异，在其生长繁殖时所要求的酸碱度（pH 〕各不相同。通常培养细菌或放线菌时，pH须周至7.0-7.5，而酵母菌则需偏酸些，pH 应调在4.5-6.0之间。

    微生物在生长和代谢过程中能引起培养基酸碱度的变化，这往往抑制了微生物的继续生长和代谢。故在制备培养基时得加适量缓冲液或不溶性碳酸盐，借以维持适宜的pH范围。当培养基中的酸碱度在6.4-7.2之间波动时可加入磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合组成的缓冲剂。若培养基中产生大量酸时，此磷酸缓冲剂不能维持恒定的pH，此时必须加入不溶性的碳酸盐（如碳酸钙），以中和微生物所产生的酸，产生的二氧化碳从培养基逸出，故阻止了培养基pH的降低。

为观察培养过程中培养基的pH 值变化，常在培养基中加人适宜的指示剂，如表2-1 所示，

 

表2-1 常用指示剂及酸碱度（感应界）指示范围

 

据表2-l ，如欲观察培养基pH 在7.0左右变化，则可选用溴百里酚蓝为宜，取此剂0.1 克。滴加0.1N的氢氧化钠并研磨使之溶解，而后加水至250毫升。每10 毫升培养基中可加配好的指示剂0.5 毫升。

 

4 .针对工作目的选制不同形式培养基

培养基的种类很多，从不同角度可分几大类。

 

（1）按对培养基组成物质的化学成分是否完全了解，可分成合成培养基、半合成培养基和天然培养基。用化学成分完全了解的各营养物质配成的培养基称为合成培养基。在实验室范围，对微生物的营养、代谢、分类鉴定．生物测定．选育种和遗传等方面的研究时，通常选配合成培养基．天然培养基是采用天然有机物。如蛋白胨，肉浸汁、酵母浸汁、牛奶、血清、土壤浸液等制成的培养基。

它具有经济方便等优点，除实验室采用外，生产上也常利用它。其缺点是它的化学成分不够清楚，不够稳定。

 

( 2 ）按物理状态可把培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种：在生产上和生理代谢等基本理论研究上选用液体培养基。加1.5-2%琼脂或5-12%明胶等凝固剂的液体培养基能凝固成固体状态，称之为固体培养基．在进行微生物分离．鉴定，计数、保藏时选配固体培养基．含有少量（0.2-0.5%）琼脂的培养基称半固体培养基，要观察细菌运动特征、鉴定菌种、测定抗菌素噬菌体的效价滴定时均可采用它。

 

（3）按培养基的特殊用途：可将培养基分为增殖培养基、选择培养基、鉴别培养基。

增殖（加富）培养基是根据所要培养或筛选的微生物的生理特征增加一定营养的培养基。如培养基中加入人血、血清、动物或植物组织提取液等等为加富培养基，用于培养要求比较苛刻的一些异养微生物．在水样或泥样中所需的菌种较少时，常选用增殖培养基．

 

选择培养基是根据某种或一类微生物的特殊营养要求或时一些物理、化学因素敏感性较强而设计的。利用这种培养基可把所需的微生物从混杂的其他微生物中分离出来。

 

选择性培养是据某些细菌对碳、氮源和其他营养物质的特殊要求而设计的。如以纤维素作唯一碳源的培养基可分离到分解纤维素的微生物；以含石蜡油为碳源的培养基可分离到利用石蜡油的微生物。用缺氮培养基可分离到固氮菌．用硫代硫酸钠或硫黄末为基本营养源的培养基可从海泥、海水或土壤中分离出排硫杆菌、氧化硫杆菌或脱氮硫杆菌等．

 

另一种办法是在培养基中加少量的对某些细菌有特殊抑制作用的染料或抗菌素．若于培养基中加低浓度（l ：100000 ) 的染料如结晶紫，亮绿、孔雀绿等制成的选择培养基中，只有革兰氏阴性细菌可生长，这方法可用于大肠杆菌的鉴别试验，如加浓度约50单位／毫升的青酶素、链霉素、四环素，能抑制细菌和放线菌，而对霉菌和酵母菌却无抑制作用。若加浓度为50-100 单位／毫升的链霉素于麦芽汁培养基中．可减少细菌生长从而分离出酵母菌。

 

鉴别培养基是加某种试剂或化学药物于培养基中．使不易从菌落特征区别出来的微生物经这种培养后，由于它们的代谢产物对试剂或化学药品反应不同，而呈现鲜明的差异，有助于快速鉴别某种微生物．如检查淡水，海水和饮料中是否含有肠道致病菌时，常用伊红美蓝培养基区别大肠杆菌和产气杆菌。当大肠杆菌发酵培养基中的乳糖时，使伊红与美蓝结合生成黑色化合物，长出的大肠杆菌菌落呈紫黑色，并带金属光泽，菌落较小，而产气杆菌菌落较大，呈棕色。

 

配制鉴别培养基必须满足以下三个条件；

① 培养基所含营养能保证所鉴定的细菌正常地生长：

② 培养基中包含有足够数量的参与反应的物质，

③ 细菌在培养基中的代谢产物不干扰观察结果。

 

特殊的天然培养基，如海洋积淡水中病毒、立克次氏体，一般培养在动植物体内或组织细胞中，而在普通培养基中不生长。现在已知100 多种病毒可自人的肠道或其他分泌物中排泄出来而污染水源．包括肠道病毒 ，如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、甲型胃肠炎病毒等。这些病毒在自来水中可活2-168 天，海水中可活2-130 天．贝类生物体内如牡蛎体内可活90天。