1. 1.4 %PPLO琼脂培养基
[用途]
分离支原体
[配法]
牛心(去脂绞碎)250g ,氯化钠5g,胰蛋白酶(不含乳糖)2.5g,蛋白胨10g ,酵母浸膏1g ,琼脂粉14g ,蒸馏水1L。
(1) 牛心消化液配制:取去脂绞碎牛心250g ,氯化钠5g及蒸馏水900ml混合;另取胰蛋白酶2.5g,溶解于100ml 5g / L 氯化钠溶液中,然后与上述牛心消化液混合,放置50-60 ℃ 水温箱内消化2h ,中间不断搅拌消化后用两层纱布过滤,滤液煮沸5min ,用滤纸过滤后,补足水分至原量,然后加酵母浸膏1g ,混匀,冷却后调pH 至8.0 ,分装后121 ℃ 灭菌15min 备用。
(2) 支原体基础琼脂:取上述牛心消化液(已加氯化钠)1L,加蛋白胨10g 和琼脂粉14g ,混合后,加热溶解调pH 至7.8-8.0,再加热煮沸,用脱脂棉或绒布过滤,过滤后分装于圆瓶中,每瓶70ml,121 ℃ 灭菌15min 备用
(3) 250g / L 鲜酵母液制备:食用鲜酵母块250g ,加蒸馏水1L ,混合后,煮沸2min ,用滤纸过滤,滤后置4 ℃ 冰箱中过夜,使之沉淀,次日吸取上清液,用150g / L 氢氧化钠溶液调pH 至8.0,再煮沸1 次,冷却后,3000r/min 离心45min ,吸取上清液,分装于瓶中,121 ℃ 灭菌15min ,放4 ℃ 冰箱中备用,可保存3 月。
(4) 倾注平板:溶解基础琼脂,冷却至80 ℃ 左右,每瓶(70ml)内立即加预温在37℃ 培养箱内的无菌马血清或小牛血清20ml , 250g / L 鲜酵母浸出液10ml,10g / L 乙酸铊溶液2.5ml ,青霉素G 钾盐溶液(20 万U / ml )0.5ml 和两性霉素B 溶液(5mg/ml)0.1ml;充分混匀后倾注9cm平板,经37℃ 培养过夜,无菌试验阴性者,存放4 ℃ 冰箱备用
注:
(1)乙酸铊是极毒药品,须特别注意安全操作
(2) 支原体美蓝琼脂平皿为分离肺炎支原体的选择性平皿,口腔、唾液分泌物中的其它支原体均被抑制生长,肺炎支原体生长为“桑椹状”无色的菌落
(3) 支原体传代、移种用0.1 %半固体琼脂,配制时除用0.1 %琼脂粉外,其它成分与支原体基础培养基相同,但不加两性霉素,此半固体琼脂分装在试管内灭菌备用。传代时将平皿上已选定的支原体菌落用无菌刀片切下一小块,直接移种于半固体管中,置适当的气体环境中,培养3-5 天后,可在琼脂小块出现“小岛状”絮片生长物,或呈颗粒状,即次代支原体
(4) 支原体传代用液体培养基:其成分与上述支原体半固体琼脂相同,不加琼脂粉和两性霉素B 。
2 肺炎支原体分离用双相培养基
[用途]
用于喉拭标本直接分离肺炎支原体
[配法]
(1)底层琼脂斜面:其成分与上述支原体半固体琼脂相同,不加两性霉素B 。无菌分装于经灭菌的链霉素空瓶中,每瓶3ml,置成斜面,此为底层
(2) 液体培养基:其成分与上述支原体传代用液体培养基相同。但在未高压灭菌前,再加入葡萄糖1g ,美蓝0.001g (即10g / L 美蓝溶液0.lml), 1g / L 酚红溶液2ml , 115 ℃ 灭菌15min ,冷却后,再加入辅助成分和防止杂菌生长的成分。然后,在上述底层琼脂斜面上,每瓶再加入液体培养基3-5ml,瓶塞用煮沸灭菌的后口橡皮塞经37℃ 培养过夜,无菌试验阴性者,存放4 ℃ 冰箱中备用,可保存1 月
注:已接种的双相培养管,培养37℃ 普通环境2-4 周,观察结果,阳性生长见双相管由淡紫色变成绿色再转变为黄色,因肺炎支原体发酵葡萄糖,还原美蓝。取阳性管用分离支原体固体平皿分离菌落,平血放入含95 %氮气和5 %二氧化碳环境中,或放入含5%二氧化碳环境中培养2-4 周,阳性平皿可见菌落生长
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