所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，这一概念不同于消毒。后者是指消灭一切致病微生物（病原体）。在发酵生产中为什么要灭菌呢？主要有以下几点原因：如不灭菌，会使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降；有些杂菌会分解产物，使生产失败；杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常；如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。
灭菌原理是直接用蒸汽灭菌，蒸汽在冷凝时能释放出大量潜热，蒸汽具有强大的穿透力，破坏菌体蛋白和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。水煮常压灭菌：100℃。或饱和蒸汽灭菌：一般121℃，30分钟。适合培养基和发酵设备灭菌。
微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：
式中：N0—开始灭菌（t=0）时原有活菌数； Nt----经时间t后残存活菌数。
k：意义同上；t ：表示理论灭菌时间
k=（2.303/t）logNt/N0；比死亡速率常数K，K值大，表明微生物容易死亡。
理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：
（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大，K值也越小。可以取耐热性芽孢杆菌的K进行计算。
(2)在计算过程中，N0，Nt如何取值？
N0 为灭菌开始时培养基中活微生物数，可以参考一般培养基中的活微生物数为（1-2）×107个/ml； Nt 通常取 0.001个，既灭菌失败的概率为千分之一。
（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，实际的设计和操作计算时间可作适当比例的延长或缩短。在实际生产中，通常采用经验数值：间歇灭菌，121℃，20—30分钟；连续灭菌，137℃，15—30s，在维持罐中保温8—20分钟。
4、灭菌温度的选择
在培养基灭菌过程中，除了杂菌死亡，还伴随着培养基成分的破坏。因此必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基的破坏降低至最低的工艺条件。
许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：
式中— 表示营养成分破环的速率，
C：表示营养成分的浓度
K'：为反应速度常数，1/s，应速度常数K'与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：
K'= A'exp- △E'/RT……（1）
式中—— ：反应速度常数，1/S
：反应的活化能（J/mol）
R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k
T：反应的绝对温度，k
同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出：
K = A×exp[-E/RT] …… （2）
（1）、（2）式可以改写成下列形式：
lg(k,2/k,1) = E,/R×(1/T1 – T2 ) …… （3）
lg(k2/k1) = E/R×(1/T1 – T2 ) …… （4）
（3）（4）的意义是指：反应的温度从T1 升高到 T2 ，其反应的速度常数分别从k,1 增加到 k,2；k1 增加到 k2；
培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：
lg(k2/k1)/lg(k,2/ k,1)= E / E, …… (5)
实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E的值为E, = 8.36—83.6*103 J/mol；而菌体死亡的活化能E芽孢：E = 418*103 J/mol；无芽孢：E = 209—250*103 J/mol。显然，（5）式的比值〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。通常所说的高温短时灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。
结论1：当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。
结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。
（二）、影响灭菌效果的因素
（1）微生物种类：不同的微生物k值不同。
（2）初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比。
（3）培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。
(4)传热与混合状况：影响受热均匀度。
(5)培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。
(6)蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。
(7)pH：酸性pH下可加快微生物热死速率
三、培养基的工业灭菌
（一）、实验室种子培养基灭菌方法
1、高压蒸汽灭菌锅、 手提式灭菌锅。容量小。
2、立式或卧式灭菌锅。容量较大， 一般能装几十瓶或几百瓶。
3、灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套， 用于大量种瓶培养基的灭菌， 一次能装几百至几千瓶(袋)。
（二）、培养基的分批灭菌
1、定义：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式，又称实罐灭菌。
2、灭菌过程
过程包括升温、保温和冷却等三个阶段，各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。培养基的升温可由两种方式实现：间接加热，在夹套或蛇管中通入蒸汽加热；直接加热，在培养基中直接通入热蒸汽加热。
灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，而冷却阶段的灭菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不计。此外，还应指出的是，应当避免长时间的加热阶段，因为加热时间过长，不仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。
在实际生产中，也可能遇到所供蒸汽不足、温度不够高的情况，这时可以适当延长灭菌时间。生产上甚至有用100℃蒸煮而达到彻底灭菌的实例。如要做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用100蒸汽蒸30min，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌的芽孢没有被杀死。 将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的孢子便发芽生长，芽孢发育成营养细胞，再30min便可杀死。如此连续反复进行2-3次，亦可达到彻底灭菌的目的。
3、分批灭菌的操作
分批灭歇是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到70℃左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120℃，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排汽，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。
由于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。
（三）、培养基的连续灭菌
1、定义：连续灭菌也叫连消，将配制好的并经预热（60～75℃）的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使在短时间内达到灭菌温度（126～132℃）。然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持3～7分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）过的发酵罐内。其温度一般以126～132 ℃为宜，总蒸汽压力要求达到0.044～0.049 MPa以上。
培养基采用连续灭菌时，需在培养基进入发酵罐前，直接用蒸汽进行空罐灭菌（空消），用无菌空气保压，待培养基流入罐后，开始冷却。灭菌时对培养基的加热可采用各种加热器。
培养基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、薄板换热器式几种方式，其过程均包括加热、维持和冷却阶段。
2、连续灭菌的流程：
（1）由热交换器组成的灭菌系统
流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。
（2）蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统
流程中采用了蒸汽喷射器，它使培养液与高温蒸汽直接接触，从而在短时间内可将培养液急速升温至预定的灭菌温度然后在该温度下维持一段时间灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速冷却，从图中可以看出，由于该流程中培养基受热时间短，营养物质的损失也就不很严重，同时该流程保证了培养基物料先进先出，避免了过热或灭菌不彻底等现象。
（3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统
连续灭菌的基本设备一般包括：
①配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70℃，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度过大而产生水汽撞击声；
②连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132）℃；
③维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；
④冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50℃后，输送到预先已经灭菌过的罐内。
（四）、间歇灭菌与连续灭菌的比较
1、歇灭菌的优点和缺点
优点是设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置；操作要求低，适于手动操作，适合于小批量生产规模；适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌。缺点是培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降；需进行反复的加热和冷却，能耗较高；不适合于大规模生产过程的灭菌；发酵罐的利用率较低。
2、连续灭菌的优点和缺点
优点是灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失；操作条件
恒定，灭菌质量稳定；易于实现管道化和自控操作；避免了复的加热和冷却，提高了热的利用率；发酵设备利用率高。缺点是对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置；操作较麻烦；染菌的机会较多；不适合于含大量固体物料的灭菌；对蒸汽的要求高。
由此可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。
