（二）、诱变育种方案设计

诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。

 

1、出发菌株的选择

工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下： ①以单倍体纯种为出发菌株； ②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。

 

2、出发菌株的纯化

为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。

 

3、单孢子悬液的制备

诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。

首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。若诱变剂产生的突变只在 DNA双链中的某一条单链，故该突变无法反映在当代的表型上。只经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟 (phenotypic lag) 。不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状 “衰退”的主要原因。

（1）供试菌株的孢子或菌体的选择

供试细胞要新培养的，细胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也好。对细菌来说，常常通过前培养达到要求。菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子，不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉或滤纸过滤。

菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞 10 ⁶ ~ 10 ⁷ 个/ml，放线菌或细菌10 ⁸ 个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。有时，也需用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释，因为有些化学诱变剂处理时，常会改变反应液的pH值。 

（2）菌悬液制备方法

细菌：在诱变处理前进行摇瓶振荡培养，利用温度和碳源控制其同步生长，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在有玻璃珠的三角瓶内振荡10min，用无菌脱脂棉或滤纸过滤，通过菌体计数，调整菌悬液的浓度。孢子：在试验中尽量采用成熟而成熟的孢子，并置于液体培养基中振荡培养到孢子刚萌发，即芽长相当孢子直径0.5－1倍。离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，计数，调整菌体浓度供诱变处理。对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。

 

4、诱变剂的种类和选择

A、诱变剂种类的选择

物理诱变剂包括：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等；化学诱变剂包括 甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。

选择诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理。对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。并结合自然分离和环境条件的改变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌落。在诱变之前还要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析，总结规律性，选择一种最佳的诱变剂。

B、最适诱变剂量的选择

诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大比例，这样可减少以后的筛选工作。

要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验。就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为90—99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。 

化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件（温度、pH等）。物理诱变剂主要控制照射距离、时间和照射过程中的条件（氧、水等），以达到最佳的诱变效果。

 

5、诱变处理

A、不同诱变处理方法

（1）紫外线照射

由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。

紫外线诱变育种的原理是：紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。  

紫外线诱变方法：将10mL菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。

不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。

 

一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。

实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。

 

（2）CO60 照射

CO60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。

一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。

 

（3）等离子输入

等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。

 

B、不同诱变处理方式

①单一因子处理：采用单一诱变剂处理，可以减少减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化。

②复合因子处理：指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。主要有：两个以上因子同时处理；不同诱变剂交替处理；同一种诱变剂连续重复使用；紫外线复活交替处理。