植原体是一类无细胞壁的原核微生物，能侵染包括农作物、林木、花卉、杂草等植物，给农、林业生产带来巨大损失，近年来，此类病害在某些重要植物处于蔓延和加重的趋势。这类微生物尚不能在人工培养基上离体培养，其细胞结构、与寄主植物的互作等方面也有其明显不同特点，研究制定此类微生物的保藏技术规程，对于植原体菌种资源的规范和安全保藏、科学研究及合理利用具有重要意义。

 

 

1   范围

本规程规定了植原体菌种保藏的基本原则、方法及技术要求。

本规程适用于各类植原体菌种的保藏。

2   术语与定义

2.1植原体  phytoplasma

指寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。

2.2植物组织培养  plant tissue culture

在无菌的条件下，将离体的植物器官和组织在人工控制的环境下培养，使其再生形成完整植株的过程。培养植原体—植物共生体即是培养已感染植原体病菌的植物外植体。

 

3   原理

植原体菌种尚不能在离体人工培养基上培养。被感染的寄主植物携带植原体，因而通过对植物茎段的繁殖，即可达到对所携带植原体的繁殖和培养。植物组织培养和营养繁殖，使植原体所受的选择压力较低，较低的温度条件可大大减缓植物和所感染植原体的代谢活动，从而减少菌株突变，降低繁殖速度，有效保持菌种原有性状。

4技术要求

4.1   保藏方法

用组织培养法保藏感染植原体的植物组织，于5-25 C温度范围内保藏。

4.2植物组织培养基

选用适于植物组织正常生长的培养基，不含四环素簇抗生素或其它对植原体生长和繁殖有抑制作用的成分。

4.3   培养温度和光照

培养温度20-28 ℃为宜

光照强度在1000-3000  lx，光期为10-14h/d

4.4   保藏温度和时间

常温保藏（20-28 ℃），保藏时间1-3个月

低温保藏（6-10 ℃），保藏时间6个月至1年。

注：保藏温度低于4 ℃会冻伤植物组织材料而导致植原体死亡。

4.5   保藏期检测

定期检查保藏菌种的房间、冷库、冰箱的温度、湿度。

检查各保藏试管有无杂菌污染现象，如发现杂菌污染，则取出该管重新移植，培养后补缺。

4.6移植复核

大量植原体-植物共生体进行移植时，各菌株的编号、所用培养基需仔细核对无误。每次移植培养后，对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录，核实无误再行存放。

4.7     保藏指标

当获得的组培苗表现典型症状或在荧光显微镜下观察到特异植原体 DNA 荧光后即可进行菌株的保藏。

5     操作方法与步骤

5.1   带菌外植体采集

在田间采集表现典型症状的新鲜枝条，剪去叶和嫩稍，经酒精和升汞等消毒剂表面消毒后，截成具节茎段，移入培养基上培养。

5.2   无杂菌组培苗的获得

外植体长出新枝后，选无杂菌感染的外植体，截取新枝，移入新配制的培养基上培养和繁殖。如培养基被杂菌污染，将组培苗再进行表面消毒处理，移入新的培养基上培养，重复操作2-3次，直至获得无杂菌组培苗为止。

5.3    组织带菌鉴定

用DAPI荧光显微镜技术和PCR技术鉴定组织带菌状况和浓度。

DAPI荧光显微镜技术步骤：取植物幼茎、叶柄或根等，进行组织切片，厚度在100mm左右，用5％戊二醛固定2小时左右，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤后，用1mg  /ml  4'6－二眯基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，最后置于落射荧光显微镜下检查韧皮部特异性植原体DNA荧光，激发滤光片波长为365nm,阻断滤光片波长为420nm。

PCR技术步骤：从组织中提取植物和植原体总DNA，用植原体16S  rRNA等基因序列的引物进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖电泳，检测特异性扩增产物谱带。

5.4  常温保藏

植原体-植物共生体在适宜的组织培养基上培养，并正常温度和光照下（20-28 C，光照强度在1000-3000  lx）进行保藏，保藏周期为1-3个月。

5.5   低温保藏

将正常温度和光照下（20-28 C，光照强度在1000-3000  lx）培养的植原体-植物共生体移入含组织培养基的试管内，移入6-10 C低温冷藏柜内保藏，1-2个月将试管暴露于正常培养温度和光照条件下补光2-3天，然后存放于低温冷藏柜继续保藏，保藏周期为6个月至1年以上。