二、主要的基因型说明
1、基因重组相关的基因型
recA (Recombination)
功能:recA基因表达 ATP依赖型 DNA重组酶,它在λ-噬菌体与基因组 DNA的溶原重组时起作用,同时具有对 DNA放射性损伤的修复功能。由 recA基因的变异所产生的基因型使同源或异源 DNA的重组不能进行,保持插入 DNA的稳定性,对 DNA的转化有利。一个菌株的基因型如果是 recA,则说明此菌株的表现型是重组缺陷的。
recB (Recombination)
功能:recB基因表达 ATP依赖型 DNase和核酸外切酶V的一个亚基,对recA的DNA重组酶起辅助和促进作用。DNase催化双链DNA的解旋和解链,核酸外切酶V催化单链DNA的裂解,在DNA的重组和损伤修复中发挥重要作用。recB基因的变异导致其DNA重组和修复功能丧失,保证了外源DNA的稳定,有利于DNA转化。
recC (Recombination)
功能:recC基因表达四种酶,即核酸外切酶V,ATP依赖型的核酸内切酶,解旋酶及ATP酶,它们和recA, recB所表达的酶相互协调作用,在DNA的重组及放射性损伤的修复中发挥作用。recC基因的变异导致DNA重组功能缺失,保证外源DNA的稳定性。
2、甲基化相关的基因型
dam (DNA adenine methylase)
功能:dam基因表达DNA腺嘌呤甲基化酶,它能催化特异序列GATC中A的甲基化,保证DNA免受限制性核酸内切酶Mbo I的切断,同时在 DNA复制时也起一定的辅助作用。dam基因的变异导致腺嘌呤(A)甲基化酶活性的缺失,使腺嘌呤(A)不被甲基化,易于获得非甲基化质粒。
dcm (DNA cytosine methylase)
功能:dcm基因表达DNA胞嘧啶甲基化酶,它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列,并使第二个C甲基化,即CmCWGG,避免 DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失,使外源DNA上的C不被甲基化,易于获得非甲基化质粒。
mcrA (Modified cytosine restriction protein a)
功能:mcrA基因表达大肠杆菌防御体系中起重要作用的mcrA酶,这种酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列,即 C5mCGG特异序列,使之分解,对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异,导致上述功能缺失,对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序(C5mCGG)失去作用,有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。
mcrB, C (Methyl cytosine-specific restriction)
功能:mcrB, C基因表达两种特异性蛋白,即mcrB蛋白和 mcrC蛋白,它们在大肠杆菌的防御系统中起重要作用。一般情况下,只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性, mcrC具有识别和调节功能,它能特异性的结合到外源 DNA上被甲基化的胞嘧啶(C)的特异序列 G5mC上,然后由 mcrB蛋白切断(mcrB蛋白是特异性切断外来 DNA中 G5mC序列的限制性核酸内切酶),防御外来 DNA的侵入。mcrB, C基因的变异,使上述的对外来 DNA的防御作用缺失,对质粒的转化有利。
mrr (Methylation requiring restriction)
功能:mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一,它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外,它对限制酶AccⅠ,CviR Ⅰ,Hinf IⅠ(Hha Ⅱ),Nla Ⅱ,Pst Ⅰ以及 N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明显的抑制作用。mrr欠损株(基因型)可用于含有N6-mA和C5-mC的DNA的转化。另外,含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体。
hsdM (Host specificitive defective)
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功能:hsdM基因所表达的DNA甲基化酶是 I型限制酶复合体(具有对 DNA切断和修补的双重功能)的一部分,它能使DNA双链上的AA (双腺嘌呤) 甲基化,保护宿主DNA不被分解。hsdM的变异使细胞内的DNA不被甲基化,易于获得非甲基化质粒。
3、点突变相关的基因型
mutS (Mutator)
功能:mutS基因表达的蛋白具有识别DNA上错配序列的功能,并能修复其错配序列(GC→AT),防止基因突变。mutS基因的变异导致DNA的错配序列不能得到修复,容易发生基因突变,这对于利用点突变进行基因改造是有利的。
mutT(Mutator)
功能:野生大肠杆菌在进行DNA复制时,细胞中的8-OXO-dGTP插入模板DNA中的DA位点的效率几乎与插入DC位点的效率相同,导致 A-T转换成 G-C,使DNA产生变异。而mutT蛋白就是特异性地降解8-OXO-dGTP成为单磷酸盐(8-OXO-dGMP),这种单磷酸盐状态的G(鸟嘌呤) 不能作为底物进行 DNA合成,从而防止了上述的基因突变。 mutT基因的变异使细胞中8-OXO-dGTP浓度增高,A→C的突变几率增大,有利于利用点突变进行基因改造。
dut (dUTPase)
功能:dut基因表达脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶(dUTPase),它能水解dUTP成为dUMP,使细胞体内dUTP的浓度维持在较低的水平,尿嘧啶(U)就不易掺入到DNA中,避免了基因发生 A→U的突变。dut基因发生突变使dUTPase活性缺失,导致dUTP浓度升高,碱基U(尿嘧啶)极易掺入到DNA中,使其发生A→U的基因突变,有利于利用点突变进行基因改造。
ung (Uracil DNA glycosylase)
功能:ung基因表达尿嘧啶 -N-糖苷酶,这种酶能特异性识别DNA单链或双链上发生突变的尿嘧啶残基,并从DNA上水解去除尿嘧啶残基,防止 DNA发生突变。ung基因的变异导致上述功能缺失,有利用点突变。
uvrB (Ultraviolet)
功能:uvrB基因表达核酸外切酶中的b亚基,这种核酸外切酶具有DNA的切补功能,对紫外线损伤的DNA有修补作用。uvrB基因的变异使细胞中核酸外切酶切除变异碱基的活性缺失,有利于点突变。
4、核酸内切酶相关的基因型
hsdR (Host specificity defective)
功能:hsdR基因表达 I型限制酶EcoK (K12株) 或 EcoB (B株),在大肠杆菌细胞中起到一种”抗体“的作用,对外来的各种 DNA有严格的限制。HsdR基因的变异导致菌株细胞内的 I型限制酶 EcoK或 EcoB活性缺失,这对于外来基因的导入及质粒转化是有利的。
hsdS (Host specificitive defective)
功能:hsdS所表达的特异性蛋白是 I型限制酶EcoK或EcoB复合体中的一部分,它专门负责hsdR酶和hsdM酶对DNA序列的特异识别。hsdS基因的变异使hsdR和hsdM不能正确识别其作用的特异DNA序列,可以保持插入DNA的稳定性。
endA (Endonuclease)
功能:endA基因表达非特异性核酸内切酶Ⅰ,它能使所有DNA双链解开,在DNA的复制和重组中起重要作用。endA基因的变异将使插入的外源 DNA更加稳定,提取的质粒纯度更高。
5、停止密码子相关的基因型
supE (Suppressor)
功能:supE基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合,使蛋白质合成停止。supE基因发生变异时,不能表达正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密码子 UAG,蛋白质合成仍能继续,并使 UAG作为一个密码子来编码谷氨酰胺(Glutamine),从而使发生了琥珀突变(AAG→UAG)的基因对蛋白质表达得以延续,因此称 supE为琥珀突变抑制因子。
supF (Suppressor)
功能:supF基因表达的阻遏蛋白与停止密码子UAG结合,使蛋白质合成停止。supF基因变异时,不能表达正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密码子 UAG,蛋白质合成仍能继续,并使 UAG作为一个密码子编码酪氨酸 (Tyrosine)。
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