第二节              培养基氢离子浓度的测定

 

     测定培养基pH的方法很多。常用比色法和pH计法。比色法是利用指示剂在不同pH溶液的颜色变化，与标准比色管（或比色板）相比，得出pH值。它的优点是不受溶液温度的影响，高压后或加热的培养基不必冷却后即可测定，使用方便。精密pH试纸也可测定，方法简便，但数值不够准确。下面介绍标准单管比色液的配制。

    配成各种酸碱度的缓冲液，再加入一定量的指示剂（如酚红或溴麝香草酚兰）即成。

两种磷酸盐试剂KH₂ P0₄和Na₂ HP0₄置于105℃干烤3小时。Na₂ HP0₄不易溶解，预先要在乳钵中研细，使用的蒸馏水需高压灭菌或者煮开。配制溶液要使用滴定管和容量瓶。

    1．指示剂的配制

    (1)酚红( PR)指示剂的配制：精确称取PR0.02克，置于玻璃乳钵中随研随加0.01mol/L氢氧化钠溶液5.46ml，加水至100ml。

    (2)溴麝香草酚兰(BTB)指示剂的配制：精确称取BTB0.4克，置于玻璃乳钵中随研随加0.05molNaOH溶液12.8ml，10倍稀释即可。

    2．标准比色管的配制

    (1)先配制两种磷酸盐溶液：

    1液：1/15mol/L的Na₂ HP0₄溶液：称取Na₂ HP0₄9.47壳，加蒸馏水至1000ml，溶解混匀。

    2液：l/15mol/L的KH₂P0₄溶液：称取KH₂ P0₄9.07克，加蒸馏水至1000ml，溶解混匀。

    (2)按表中所列配制pH标准管

表1    PR pH标准比色管配制

   

 l液与2液混合为40ml，分别加入0.02% PR指示剂2ml混匀。分装试管，每管l0ml，封口，121℃高压灭菌20分钟，贴签、装盒。

    表2 BTBpH标准比色管配制

 

    1液与2液混合为100 ml，分别加入0.04%BTB指示刹5ml混匀．，分装试管．每管10ml，封口。121℃高压灭菌20分钟，贴签、装盒。

    3．标准pH比色管使用说明

    标准pH比色管，共有比色管9支，每管pH间隔0.2，另加蒸馏水1管，并附有比色用空管4支。

    比色管的名称          浓度(%)           标准比色范围(pH)

    PR指示剂              0.02               6.8 -8.4

    BTB指示剂             0.04                6.0 -7.6

    酚红( Pnenol red)指示剂的变色范围在pH6.8- 8.4．酸性时为黄色，碱性为粉红色，中性为淡红色。溴麝香草酚蓝( Bromothymol blue)指示剂范围在pH6.0—7.6．酸性时为黄色，碱性为蓝色，中性为黄绿色。在培养基中这两种指示剂应用范围最广。

 4．pH的校正

    若测定管过酸或过碱可用0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸溶液矫正，直至颜色与标

准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加l滴后要充分混匀，比色后再加滴2滴（有

时仅半滴）准确记录加入的量。

目前国外有pH比色盘，适于培养基pH测定。使用更方便，检测数值更准确。

表3培养基常用指示剂及变色范围

 

 

常用指示剂的配制：

    最常用的指示剂有溴麝香草酚蓝(BTB)、溴甲酚紫(BP)、酚红(PR)和酸性复红(Andrade)。它们的配制如下。

    1．溴麝香草酚蓝指示剂的变色范围为pH6.8—7.7，酸性时为黄色，碱性时为蓝色，中性时为黄绿色，在培养基中应用最广。

    (1)称取0.4g溴麝香草酚蓝置研钵中，徐徐加入12.8ml的0.05mrl氢氧化钠，边加边研磨，加完后再充分研磨使全部溶解。

(2)用蒸馏水稀释至100ml，即为0.4%溴麝香草酚蓝指示剂，存棕色试剂瓶内放暗处，备用。滴定培养基的pH时，再用蒸馏水稀释至10倍，为0.04%的溶液。

2．溴甲酚紫指示剂的变色范围为pH5.4~7.0，酸性时为黄色，碱性时为紫色。

    (1)称取0.4g溴甲酚紫置研钵中，徐徐加入13.8ml的0.05 mol氧氧化钠，边加边研磨，加完后再充分研磨使全部溶解。

    (2)用蒸馏水稀释至100ml，即为0.4%溴甲酚紫指示剂，存棕色试剂瓶内放暗处，备用。也可配成1.6%的乙醇溶液。

    3．酚红指示剂的变色范围为pH6.9—8.5，酸性时为黄色，碱性时为红色，中性时为橘黄或橙色。

    (1)称取0.4g酚红置研钵中，徐徐加入23.5m1的0.05mol氢氧化钠，边加边研磨，加完后冉充分研磨使全部溶解。

    (2)用蒸馏水稀释至100ml，即为0.4%酚红指示剂，存棕色试剂瓶内放暗处，备用。

滴定时用0.02%的溶液，即用蒸馏水再稀释至20倍。

    4．酸性复红指示剂在中性和碱性时无色，酸性时为红色，颜色反应稳定，不会有可疑的结果，故推荐为标准糖发酵管的指示剂。

    称取酸性复红0.5g置研钵中，边磨边加蒸馏水约50ml使溶解，再滴加1mol氢氧化钠，边加边混合，使溶液由红色变为棕红色，直至草黄色为止，约需1mol氢氧化钠15~20ml，最后补足蒸馏水至100ml。滴加碱液时，应边加边仔细观察，切勿1次加入过多或过快，以免过量。

 

表4几种常见菌对pH的适应范围