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微生物培养基质控与图解——细菌的生长与培养基



录入时间:2010-8-5 15:21:06 来源:青岛海博

第二节  细菌的生长与培养基
培养基(Culture Medium)是微生物生长、分离鉴别的营养基础。培养基是医学卫生研究、医药工业生产、临床细菌检验、流行病学调查及生物制品制造等行业的基础。培养基在微生物领域中发挥着重要的作用。
    目前,除麻风杆菌、梅素螺旋体等少数菌种外,绝大多数细菌都可以在人工培养基上生长,细菌培养必须满足不同细菌的生长条件。
一、细菌生长的一般条件
    细菌生长繁殖的必要条件是:
    1.充足的营养。这是细菌生长繁殖所需的原料和能量的来源。
    2.适宜的酸碱度。pH7.2~7.6条件下,多数细菌体内酶的活性最强,有利于新陈代谢;少数菌必须在偏酸或偏碱的条件下生长,如结核杆菌为pH6.4~7.0,乳酸杆菌为pH5.5,霍乱弧菌在pH8.8时生长最好。
    3.合适的温度。通常37℃适合病原菌生长,但各类细菌对温度的要求差异较大,如鼠疫杆菌和小肠结肠耶尔森菌是28℃,空肠弯曲菌是42℃。
    4.必要的气体环境。根据细菌对氧需求的不同可将细菌分成四类:
    (1)专性需氧菌(obligate aerobe)。此类细菌具有完善的呼吸酶系统,需要分子氧作为受氢体完成有氧呼吸,在无游离氧的环境中不能生长。如结核杆菌、霍乱弧菌等均属此类。
    (2)微需氧菌(microaerophilic bacterium)。此类细菌在低氧压下(5%~10%)生长最好,当氧压超过10%时对其有抑制作用。如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等。
    (3)兼性厌氧菌(facultative  anaerobe)。兼有有氧呼吸和无氧酵解两种功能,不论在有氧或无氧环境都能生长,但以有氧时生长较好。大多数病原菌属此类。
    (4)专性厌氧菌(obligate anaerobe)。此类细菌缺乏完善的呼吸系统,只能在无氧环境中进行酵解。在有游离氧条件下,不能利用分子氧,而且还遭受分子氧的毒害,甚至死亡。如破伤风杆菌、脆弱拟杆菌等属此类。
二、培养基的分类
    (一)按培养基用途分
    1.营养培养基。含微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基常用以牛肉浸粉、蛋白胨、氯化钠为基础,也可增加所需的其他营养物质,如血液等。琼脂是培养基中常用的凝固剂,以支撑细菌的生长形态形成菌落,它对细菌无营养价值。
  2.增菌运送培养基。将可疑标本接种于运送培养基中。增菌培养基为液体,是扩大培养的手段,也是细菌生化反应的主要培养方法。
  3.选择鉴别培养基。在培养基中加入指示剂或化学物质,抑制某些细菌生长而有助于需要的细菌生长,或通过指示剂颜色变化分离鉴别细菌。
  4.特殊培养基。包括厌氧培养基及其他(抗生素效价测定和药敏试验)培养基。
    (二)按培养基物理性状分
    1.液体培养基。将营养物质溶解于液体中,调整pH灭菌后即为液体培养基。常用于细菌增菌或观察细菌的生化反应。
    2.固体培养基。液体培养基中加入13~15g/L琼脂,溶化后凝固成固体培养基。制成平皿,用于分离培养、活菌计数、选择培养、药敏试验。固体培养基可在试管中制成斜面用于菌种传代和短期保存。
    3.半固体培养基。液体培养基中加入2~5g/L琼脂。用于细菌动力观察和菌种保存
三、致病性细菌的特殊生长条件
    由于细菌种属不同,营养需求不同,按细菌外形可分为球菌、杆菌和螺形菌。现将所需的培养条件简述如下。
    1.球菌( coccus)
    呈圆球形、矛头状或肾形,单个球菌直径约为0.5~3.0um。繁殖时按细菌排列方式不同可分双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌和葡萄球菌。常见球菌包括葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌及淋球菌等。它们可引起人类化脓性感染,又称为化脓性球菌。在血琼脂平板上,金黄色葡萄球菌呈现透明溶血环。表皮葡萄球菌等在血平板上无溶血现象。链球菌需要在含血液或血清培养基上生长。根据菌落周围溶血环特点分为三类:不溶血、形成完全透明溶血环(β溶血)和草绿色溶血环(α溶血)。肺炎链球菌在含血液培养基上生长,菌落周围形成草绿色溶血环。奈瑟菌属营养要求高,常用巧克力色血琼脂平板分离培养,因通过血液加热后可释放出大量的x、v因子,供细菌生长需要。
  2.杆菌( bacillus)
多呈直杆状,少有微微弯曲。杆菌的长短、粗细和弯度随菌种不同而异。杆菌的直径约为0.2 - 2um,长短0.5~20um不等。杆菌菌体两端平齐,如炭疽杆菌。两端呈尖状如梭杆菌,其中艰难梭菌生长条件苛刻,需加血严格厌氧培养。也有一端膨大呈棒状,如白喉杆菌在吕氏血清培养基上生长最快,形态最典型,呈白色,圆型凸起,光滑菌落。亚碲酸钾血琼脂上菌落呈黑色,常作为本菌的筛选鉴别。这是因为亚碲酸钾能进入白喉杆菌菌体被还原成黑色金属碲。亚碲酸钾可抑制杂菌生长,而白喉杆菌不受影响。菌体两端呈分枝状为分枝杆菌,如结核分枝杆菌专性需氧,最适pH6.4~7.0。营养要求高,生长缓慢。常用L-J (Lo-wenstein - Jensen)培养基,内含蛋黄、甘油、马铃薯、天门冬素、无机盐和孔雀绿。孔雀绿为选择性抑制剂,可阻止腐败菌生长。培养时间需8天以上至8周。菌落特点为干燥、粗糙、质硬、乳白色或乳酪色。
    肠杆菌属是寄生在人或动物肠道中一大群革兰阴性杆菌。多数有鞭毛,需氧或兼性厌氧。营养要求不高,能在普通培养基上生长。但肠杆菌属生化反应活跃,能分解多种糖类、蛋白质形成不同的代谢产物。常见的有大肠埃希茵、沙门菌和志贺菌,分解糖属发酵反应。
    3.螺形菌
    螺菌( spiral bacterium)菌体弯曲。根据弯曲个数分为只有一个弯曲的弧菌(vihrio)和数个弯曲的螺菌( spirillum)。弧菌属中,霍乱弧菌营养要求不高,耐碱不耐酸,在pH8.8—9.0的碱性蛋白胨水或碱性琼脂平板上生长良好。霍乱弧菌和拟态弧菌可在无盐胨水中生长。副溶血性弧菌是一种嗜盐弧菌,在含3%—4%NaCl培养基中生长良好。目前常用TCBS琼脂培养基分离霍乱弧苗,该培养基含有硫代硫酸盐、枸橼酸盐、胆盐及蔗糖,可选择性地抑制其他肠道菌属,有利于弧菌生长。霍乱弧菌可分解蔗糖呈黄色菌落。副溶血性弧菌则呈蓝绿色。
    弯曲菌是一类呈逗号或S形革兰阴性菌。需要在加血培养基上生长,营养条件高,需含5%氧气,10%二氧化碳,85%氮气中培养。使人体致病的菌为空肠弯曲茼。最常见的螺杆菌是幽门螺杆菌( Hp)。37℃生长,营养要求高,培养基中需加血液、血清,常引起人胃及十二指肠溃疡。
    细菌的大小、形态和细菌细胞排列是细菌的重要生理特征之一。一般而言,在适宜的生长条件下培养8~18小时,细菌的生理特征最为典型,宜选择细菌的对数生长期观察细菌形态和大小。
    通过标本的涂片及染色,能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性,以及荚膜、鞭毛、芽胞、异染颗粒等结构,有助于细菌的初步识别或诊断。
    对细菌进行染色检查,应先制作细菌涂片。临床标本可直接涂抹于洁净的载玻片上;液体培养基中的细菌取培养液直接涂于载玻片上;对于固体培养基上的菌落,则需在载玻片进行固定,以杀死细菌,固定细胞质和结构,改变细菌对染色的通透性。一般用火焰固定,有时根据需要用冰冻干燥法或化学方法,如醇、酸、氯化高汞等固定。

 

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