第二节  细菌的生长与培养基

培养基(Culture Medium)是微生物生长、分离鉴别的营养基础。培养基是医学卫生研究、医药工业生产、临床细菌检验、流行病学调查及生物制品制造等行业的基础。培养基在微生物领域中发挥着重要的作用。

    目前，除麻风杆菌、梅素螺旋体等少数菌种外，绝大多数细菌都可以在人工培养基上生长，细菌培养必须满足不同细菌的生长条件。

一、细菌生长的一般条件

    细菌生长繁殖的必要条件是：

    1.充足的营养。这是细菌生长繁殖所需的原料和能量的来源。

    2．适宜的酸碱度。pH7.2~7.6条件下，多数细菌体内酶的活性最强，有利于新陈代谢；少数菌必须在偏酸或偏碱的条件下生长，如结核杆菌为pH6.4~7.0，乳酸杆菌为pH5.5，霍乱弧菌在pH8.8时生长最好。

    3．合适的温度。通常37℃适合病原菌生长，但各类细菌对温度的要求差异较大，如鼠疫杆菌和小肠结肠耶尔森菌是28℃，空肠弯曲菌是42℃。

    4．必要的气体环境。根据细菌对氧需求的不同可将细菌分成四类：

    (1)专性需氧菌(obligate aerobe)。此类细菌具有完善的呼吸酶系统，需要分子氧作为受氢体完成有氧呼吸，在无游离氧的环境中不能生长。如结核杆菌、霍乱弧菌等均属此类。

    (2)微需氧菌(microaerophilic bacterium)。此类细菌在低氧压下(5%~10%)生长最好，当氧压超过10%时对其有抑制作用。如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等。

    (3)兼性厌氧菌(facultative  anaerobe)。兼有有氧呼吸和无氧酵解两种功能，不论在有氧或无氧环境都能生长，但以有氧时生长较好。大多数病原菌属此类。

    (4)专性厌氧菌（obligate anaerobe）。此类细菌缺乏完善的呼吸系统，只能在无氧环境中进行酵解。在有游离氧条件下，不能利用分子氧，而且还遭受分子氧的毒害，甚至死亡。如破伤风杆菌、脆弱拟杆菌等属此类。

二、培养基的分类

    （一）按培养基用途分

    1．营养培养基。含微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基常用以牛肉浸粉、蛋白胨、氯化钠为基础，也可增加所需的其他营养物质，如血液等。琼脂是培养基中常用的凝固剂，以支撑细菌的生长形态形成菌落，它对细菌无营养价值。

  2．增菌运送培养基。将可疑标本接种于运送培养基中。增菌培养基为液体，是扩大培养的手段，也是细菌生化反应的主要培养方法。

  3．选择鉴别培养基。在培养基中加入指示剂或化学物质，抑制某些细菌生长而有助于需要的细菌生长，或通过指示剂颜色变化分离鉴别细菌。

  4．特殊培养基。包括厌氧培养基及其他（抗生素效价测定和药敏试验）培养基。

    （二）按培养基物理性状分

    1．液体培养基。将营养物质溶解于液体中，调整pH灭菌后即为液体培养基。常用于细菌增菌或观察细菌的生化反应。

    2．固体培养基。液体培养基中加入13~15g/L琼脂，溶化后凝固成固体培养基。制成平皿，用于分离培养、活菌计数、选择培养、药敏试验。固体培养基可在试管中制成斜面用于菌种传代和短期保存。

    3．半固体培养基。液体培养基中加入2~5g／L琼脂。用于细菌动力观察和菌种保存

三、致病性细菌的特殊生长条件

    由于细菌种属不同，营养需求不同，按细菌外形可分为球菌、杆菌和螺形菌。现将所需的培养条件简述如下。

    1．球菌( coccus)

    呈圆球形、矛头状或肾形，单个球菌直径约为0.5~3.0um。繁殖时按细菌排列方式不同可分双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌和葡萄球菌。常见球菌包括葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌及淋球菌等。它们可引起人类化脓性感染，又称为化脓性球菌。在血琼脂平板上，金黄色葡萄球菌呈现透明溶血环。表皮葡萄球菌等在血平板上无溶血现象。链球菌需要在含血液或血清培养基上生长。根据菌落周围溶血环特点分为三类：不溶血、形成完全透明溶血环（β溶血）和草绿色溶血环（α溶血）。肺炎链球菌在含血液培养基上生长，菌落周围形成草绿色溶血环。奈瑟菌属营养要求高，常用巧克力色血琼脂平板分离培养，因通过血液加热后可释放出大量的x、v因子，供细菌生长需要。

  2.杆菌( bacillus)

多呈直杆状，少有微微弯曲。杆菌的长短、粗细和弯度随菌种不同而异。杆菌的直径约为0.2 - 2um，长短0.5~20um不等。杆菌菌体两端平齐，如炭疽杆菌。两端呈尖状如梭杆菌，其中艰难梭菌生长条件苛刻，需加血严格厌氧培养。也有一端膨大呈棒状，如白喉杆菌在吕氏血清培养基上生长最快，形态最典型，呈白色，圆型凸起，光滑菌落。亚碲酸钾血琼脂上菌落呈黑色，常作为本菌的筛选鉴别。这是因为亚碲酸钾能进入白喉杆菌菌体被还原成黑色金属碲。亚碲酸钾可抑制杂菌生长，而白喉杆菌不受影响。菌体两端呈分枝状为分枝杆菌，如结核分枝杆菌专性需氧，最适pH6.4~7.0。营养要求高，生长缓慢。常用L-J (Lo-wenstein - Jensen)培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、天门冬素、无机盐和孔雀绿。孔雀绿为选择性抑制剂，可阻止腐败菌生长。培养时间需8天以上至8周。菌落特点为干燥、粗糙、质硬、乳白色或乳酪色。

    肠杆菌属是寄生在人或动物肠道中一大群革兰阴性杆菌。多数有鞭毛，需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长。但肠杆菌属生化反应活跃，能分解多种糖类、蛋白质形成不同的代谢产物。常见的有大肠埃希茵、沙门菌和志贺菌，分解糖属发酵反应。

    3．螺形菌

    螺菌( spiral bacterium)菌体弯曲。根据弯曲个数分为只有一个弯曲的弧菌（vihrio）和数个弯曲的螺菌( spirillum)。弧菌属中，霍乱弧菌营养要求不高，耐碱不耐酸，在pH8.8—9.0的碱性蛋白胨水或碱性琼脂平板上生长良好。霍乱弧菌和拟态弧菌可在无盐胨水中生长。副溶血性弧菌是一种嗜盐弧菌，在含3%—4%NaCl培养基中生长良好。目前常用TCBS琼脂培养基分离霍乱弧苗，该培养基含有硫代硫酸盐、枸橼酸盐、胆盐及蔗糖，可选择性地抑制其他肠道菌属，有利于弧菌生长。霍乱弧菌可分解蔗糖呈黄色菌落。副溶血性弧菌则呈蓝绿色。

    弯曲菌是一类呈逗号或S形革兰阴性菌。需要在加血培养基上生长，营养条件高，需含5%氧气，10%二氧化碳，85%氮气中培养。使人体致病的菌为空肠弯曲茼。最常见的螺杆菌是幽门螺杆菌( Hp)。37℃生长，营养要求高，培养基中需加血液、血清，常引起人胃及十二指肠溃疡。

    细菌的大小、形态和细菌细胞排列是细菌的重要生理特征之一。一般而言，在适宜的生长条件下培养8～18小时，细菌的生理特征最为典型，宜选择细菌的对数生长期观察细菌形态和大小。

    通过标本的涂片及染色，能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性，以及荚膜、鞭毛、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或诊断。

    对细菌进行染色检查，应先制作细菌涂片。临床标本可直接涂抹于洁净的载玻片上；液体培养基中的细菌取培养液直接涂于载玻片上；对于固体培养基上的菌落，则需在载玻片进行固定，以杀死细菌，固定细胞质和结构，改变细菌对染色的通透性。一般用火焰固定，有时根据需要用冰冻干燥法或化学方法，如醇、酸、氯化高汞等固定。