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细菌检验工作的基本技术——基本染色法(上)



录入时间:2010-7-14 9:14:36 来源:互联网

水洗。
    4.干后镜检。分枝杆菌呈红色,背景为蓝色。
    *:奴卡菌、放线菌标本染色时,脱色剂改用2%硫酸水溶液。
   
()金胺O-罗丹明B染色法
    
    1.罗丹明B液:罗丹明B  0.1g加蒸馏水100ml;
    2.0.1%金胺O液:金胺O  0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸5ml,混匀;
    3.3%盐酸酒精;
染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时,用接种环沾取菌液点在载玻片上,标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时,先取生理盐水 1滴,置玻片上,用接种针挑取菌落,在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式,或造成细菌鞭毛脱落,影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥,并经火焰固定,固定温度不宜过高,以玻片背面接触手背不烫为准,否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。
 
一、革兰染色
本染色是最基本的染色法,可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
试剂

1. 结晶紫溶液
             A液:    结晶紫           2g
                                95%乙醇              20ml
                  B液:    草酸铵        0.8g
                                蒸馏水        80ml
    需在用前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。
2.碘液
碘              1g
碘化钾       2g
蒸馏水       300ml
碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升水,使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。
也可用少量蒸馏水,先将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。
3.脱色液:95%乙醇。
4.复染液
      A. 贮存液:  沙黄                     2.5g
                       95%乙醇              100ml
      B. 应用液:  A液               10ml
                        蒸馏水          90ml

 
染色方法:
1.涂片经火焰固定,加结晶紫液染1 min,清水冲去染液。
      2.加碘液染l min,水洗。
      3.加脱色液,不时摇动约10~30s,至无紫色脱落为止,水洗。
      4.加复染液,染30s,水洗。
      5.干后镜检。
 
二、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰标本时,可以适当增加标本涂片的厚度,以提高检出率。染厚涂片时,须掌握复染色时间。如果背景过深,影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性,取培养菌落涂片染色时,呈现两种现象,视野中有些菌细胞阳性,另外一些则阴性;有时同一个菌体上,红色的深浅亦有不同,观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法:① 碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。 ② 荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法)。
(一)  碱性复红染色法
1.萋纳石炭酸复红溶液
             碱性复红乙醇饱和溶液              10ml
             5%石炭酸溶液                   90ml
2.脱色剂 *
             浓盐酸                                3ml
             95%乙醇                                   97ml
3.复染液(吕弗勒美蓝液)
美蓝乙醇饱和溶液                     30ml
10%氢氧化钾                            0.1ml
蒸馏水                               100ml
染色方法
1.涂片经火焰固定,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现,切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间),水洗。
    2.加脱色剂,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗。
    3.加复染液,染0.5~l min,
4.稀释美蓝液:吕弗勒美蓝液10ml,加蒸馏水90ml,混匀。
方 
1.  涂片固定后加第1液30~90s。
2.  弃去第1液后加第2液染15min。
3.  用第3液脱色1~2min,水洗。
4.  滴加第4液染30s,水洗,待干,荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。
   

 

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