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    工业微生物产生菌的筛选(七)



    录入时间:2010-6-23 16:28:09 来源:绿谷生物

    (四)组织分离法
    组织分离法是由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉素,从根瘤中分离根瘤菌及从各种食用菌的子实体中分离孢子等。
    1. 对一般有病组织的分离方法
    切除小块含菌组织,用干净水洗去组织表面污物。以10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2~5分钟进行表面消毒,无菌水冲洗。将消毒后的组织移到平皿培养基上,置于适宜温度(25~26℃)培养一定时间,即可在组织周围四÷长出微生物。用肉眼或显微镜观察菌落,基本确认后挑入斜面培养基中培养。由这种方法挑选的菌株往往不纯,必须在琼脂平板上再分离纯化,然后挑取单个菌落于斜面,进一步筛选。
    从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌:取新鲜健壮的根瘤,经漂白粉或升汞溶液等进行表面消毒后,用无菌镊子将根瘤压破,取出汁液少许与分离培养基混合倒入平皿中,摊平,培养后在平板上长出菌落,经镜检观察后确认典型菌落,移入斜面。
    2. 食用菌孢子分离法
    食用菌的孢子分离法通常有两种,即多孢子分离和单孢子分离。多孢子分离有混杂现象,不易筛选到优良稳定的菌株。因此,从育种角度最好采用单孢子分离。两种方法的分离步骤、方法介绍如下:
    (1)多孢子分离法
    取产量高、朵大、健壮无病并即将成熟的初生和单生子实体,用清水洗净表面污物,对子实体外有膜保护着的菇类,如蘑菇、草菇,在0.1%~0.2%升汞溶液浸泡2~3 min,用无菌水冲洗数次。对子实体无膜外露的平菇等,不适于用升汞溶液浸泡,要用75%的酒精进行表面消毒,再用无菌水冲洗。食用菌的孢子着生在子实体的腹面的菌褶上,成熟时会自动弹出来。孢子采集装置:用一条两端弯成钩的铁丝,一端钩着一块成熟的蚕豆大子实体,另一端挂在三角瓶的瓶口上。三角瓶内事先制备好马铃薯—蔗糖培养基平板。悬挂的子实体距离培养基平板2~3cm。适温培养1~2天,就有孢子陆续弹落于三角瓶底部的培养基上,经过4~5天,孢子萌芽成菌丝,及时将菌丝尖端接入到斜面培养基上培养,然后进行生产性能对比试验。
    (2)单孢子分离法
    取一条铁丝,弯曲成蚊香支架形状,放在已消毒的玻璃板上。将消毒后的子实体悬挂在支架上方,下方置一个已灭菌的去盖的培养皿,然后罩一个钟罩,周围缝隙用凡士林封好。将这套孢子收集器移到恒温室内培养1~2天,将有大量孢子弹到平皿上,收集孢子。以上操作全部在超净台或无菌室内进行。将收集到的孢子用稀释法在马铃薯—蔗糖培养基平板上进行单孢子分离,培养后把单孢子长出的菌落移接到斜面上,进行生产性能比较试验。
    (五)单细胞或单孢子分离法
    采用特殊的仪器设备进行单细胞或单孢子的分离。具体方法有多种,现主要介绍柠檬酸产生菌采用的小滴分离纯化方法。操作如下:将待纯化的孢子悬液稀释约为1500ml-1,用校正口径的滴管(每毫升400滴)吸取孢子并均匀滴于无菌干燥盖玻片上,将其小心翻转于凹玻片的孔穴上,穴内加一滴已灭菌的培养液,盖玻片和载玻片用凡士林密封。显微镜下观察每个小滴,将只有一个孢子的小滴位置作好记录,恒温培养,挑取单菌落于斜面。
    除用凹玻片,还可用滤纸进行单细胞或单孢子分离。具体作法如下:取与皿内径大小一致的滤纸3~4层,浸在培养液中,取出放在空皿内,在滤纸上滴几滴甘油以防干燥,盖好皿盖,灭菌。将稀释为1500ml-1的孢子悬液用上述滴管滴在滤纸上,每皿约点20点滴左右,经恒温培养,每滴约出现10个菌落,将单菌落移接于斜面上。该方法能够得到单细胞或单孢子,较为精确,但操作时要细,否则不易得到理想结果。

     

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