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苯硫氨酯、奥芬达唑和苯硫苯咪唑检测方法



录入时间:2010-4-6 13:21:59 来源:青岛海博

1.  分析目标化合物

苯硫氨酯,奥芬达唑,奥芬达唑砜,苯硫苯咪唑

2.仪器设备

带紫外分光光度检测器(HPLC(UV))或多波长检测器(HPLC(DAD))的高效液相色谱仪,液相色谱—质谱仪(LC/MS)

3.试剂
甲醇
正己烷
乙腈
无水硫酸钠
正丙醇
过氧化氢
 亚硫酸钠溶液
 氢氧化钠溶液
二乙烯基苯基-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱(200 mg):在内径 12~13 mm聚乙烯管中装填200mg二乙烯基苯基-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分离特性的物质。
七氟丁酸: 七氟正丁酸
苯硫氨酯标准品:含苯硫氨酯99%以上,熔点为129℃~130℃。
苯硫苯咪唑标准品:含苯硫苯咪唑98%以上,熔点为233℃(分解)。

4.试验溶液的配制

1) 提取方法
称取5.0g搅碎混合均匀的样品,加入30mL乙腈、20mL乙腈饱和正己烷和10g无水硫酸钠均质后,以每分钟3,000转离心分离5分钟。乙腈层和正己烷层移入分液漏斗中,收集乙腈层。正己烷层加入离心分离的残留物中,再加入20mL乙腈,激烈振荡混合后,以每分钟3,000转离心分离5分钟。舍弃正己烷层,将乙腈层合并于前面的乙腈层中,加入10 mL正丙醇,40℃以下浓缩,除去溶剂。
2) 砜化
将1)所得的残留物溶解于0.5 mL无水乙酸后,加入0.5 mL过氧化氢混合,室温下放置30分钟。加入5 mL 1 mol/L 亚硫酸钠溶液混合,室温下放置10分钟后,加入10 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液。
3) 净化方法
在二乙烯基苯基- N-乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱(200 mg)中顺次注入10m L甲醇、10mL水,舍弃流出液。柱中注入2)所得的溶液后,注入10mL水,舍弃流出液。注入10mL甲醇,溶出液在40℃以下浓缩,除去溶剂。残留物中加入1 mL甲醇溶解,作为试验溶液。

5.标准曲线的制作

苯硫氨酯试验时,将苯硫氨酯标准品配制成 0.05~50 mg/L 的甲醇溶液数点。奥芬达唑、奥芬达唑砜和苯硫苯咪唑试验时,将苯硫苯咪唑标准品配制成0.05~50 mg/L 的甲醇溶液数点。将1 mL各标准品的甲醇溶液在40℃以下浓缩,除去溶剂。残留物按照与4.试验溶液的制备中2)砜化和3)净化方法相同操作,分别注入HPLC 中,用峰高法或峰面积法绘制成标准曲线。

6.定量试验

注入试验溶液于HPLC中,按照5.的标准曲线分别求得苯硫氨酯和苯硫苯咪唑的含量,按下式求得奥芬达唑砜的含量。
奥芬达唑砜的含量=(苯硫氨酯的含量× 0.74)+(苯硫苯咪唑的含量× 1.11)

7.测定条件

1) 苯硫氨酯试验
① HPLC
检测器: UV 或DAD(波长 280 nm 附近的最大波长)
柱:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒径 2~5 µm),内径2.0~6.0 mm,长100~250 mm。
柱温: 40℃
流动相: 乙腈:0.005 mol/L七氟丁酸溶液(2:3)的混合溶液
保留时间标准: 7~10 分钟
② LC/MS
柱:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒径 2~5 µm),内径2.0~6.0 mm,长100~250 mm。
柱温:40℃
流动相:乙腈:0.005 mol/L七氟丁酸溶液(2:3)的混合溶液。
主离子 ( m/z): ESI+ 479
保留时间标准: 7~10 分钟
2) 奥芬达唑、奥芬达唑砜和苯硫苯咪唑试验
① HPLC
检测器: UV 或DAD(波长 290 nm附近的最大波长)
柱:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒径 2~5 µm),内径2.0~6.0 mm,长100~250 mm。
柱温: 40℃
流动相:乙腈:0.005 mol/L七氟丁酸溶液(3:7)的混合溶液。
② LC/MS
柱:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒径 2~5 µm),内径2.0~6.0 mm,长100~250 mm。
柱温: 40℃
流动相:乙腈:0.005 mol/L七氟丁酸溶液(3:7)的混合溶液。
主离子 ( m/z): ESI+ 332
保留时间标准: 7~10 分钟

8.定量限

0.01 mg/kg(奥芬达唑,奥芬达唑砜,苯硫氨酯和苯硫苯咪唑中分别以奥芬达唑砜计)

9.注意事项

1)检测方法概述
本方法用乙腈从样品中提取奥芬达唑,奥芬达唑砜,苯硫氨酯和苯硫苯咪唑,乙腈/正己烷分配脱脂后,用无水乙酸和30%过氧化氢将苯硫氨酯氧化成砜体、苯硫苯咪唑和奥芬达唑氧化为奥芬达唑砜,HPLC(UV 或DAD)分别测定,LC/MS确证。
2) 注意点
① 因无水乙酸、30%过氧化氢、亚硫酸钠的反应性高,操作中要小心。此外,因这些试剂经常容易变化,保管时要小心。
② 对于砜化,加入1 mol/L 亚硫酸钠溶液和1 mol/L 氢氧化钠溶液时,因激烈发热要小心。
③ 确认砜化结束,根据需要用HPLC和LC/MS测定奥芬达唑,苯硫氨酯和苯硫苯咪唑。
作为各测定条件的例子:使用内径 3.0 mm,长150 mm 的柱时,
奥芬达唑:流动相:乙腈:0.05%三氟乙酸(1:4)的混合溶液,流速:0.4 mL/min,UV 测定波长:290 nm,MS 测定离子: ESI+ 316 ( m/z),保留时间: 8 分钟。
苯硫氨酯:流动相:乙腈:0.05%三氟乙酸(1:1)的混合溶液,流速:0.4 mL/min,UV测定波长:280 nm,MS测定离子: ESI+ 447 ( m/z),保留时间:约11 分钟。
苯硫苯咪唑:流动相:乙腈:0.05%三氟乙酸(2:3)的混合溶液,流速:0.4 mL/min,UV测定波长:290 nm,MS 测定离子: ESI+ 300 ( m/z),保留时间:约5分钟。
其他的测定条件按照7.测定条件的进行。
④ 在二乙烯基苯基-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱(200 mg)中注入砜化所得的溶液时,如残留过氧化氢,小柱中会分解产生气泡,使溶液流出不一致。此时,加压吸引强制流出。

 

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