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苄青霉素检测方法



录入时间:2010-3-18 13:41:26 来源:青岛海博

1.分析目标化合物

苄青霉素

2、试剂

    除下列试剂外,使用附录2所列试剂。
    继代保存用培养基:由酪蛋白氨基酸、肉汤、氯化钠、琼脂等组成的培养基。
    检査用平板:在1000mL加温溶解后保持55℃的试验用培养基中加入5mL试验菌液,混合后,注入8mL于内径85mm培养皿中,水平保持至凝固。
    试验菌液:将继代培养基中继代培养的Bacillus stearothermophilus var.calidolactisC―953菌株接种到增殖用培养基中,在55℃培养6小时,作为试验菌液。
    试验用培养基:由肉牛心汤、胨、氯化钠、琼脂等组成。
    増殖用培养基:由酵母膏,トリプトン,葡萄糖等组成。
    圆盘:使用直径10mm,厚1.5mm 的牛津杯。
    磷酸缓冲液(pH6.0):将7.0g磷酸二氢钾溶解在500mL水中,6.0g磷酸氢二钠溶解在500mL水中,将二份溶液混合。

3.标准品

苄青霉素钠:含苄青霉素1,650 単位/mg 以上,熔点为129℃~130℃。

4.试验溶液的制备

a  提取方法
①肌肉、肝脏和肾脏:
    肌肉:尽可能除去脂肪层,搅碎混合均匀后,称取其5. 0g。
    肝脏和肾脏:搅碎混合均匀后,称取其5. 00g。
    加入30mL水,搅拌后,5mL 0.17mol/L 硫酸和5mL 5%钨酸钠溶液,用振荡器激烈振荡5分钟,以每分钟3500转离心分离5分钟后,水层抽滤。沈淀中加入20mL水,用振荡器激烈振荡5分钟后,按上述同样操作离心分离,水层抽滤。合并两滤液,加入8 mL 25%氯化钠溶液。
②奶
    称取25.0g样品,加入25mL水和5mL飽和乙二胺四乙酸二钠溶液,用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3500转离心分离5分钟,水层抽滤。滤液中加入6mL 25%氯化钠溶液。
b 净化方法
    在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱(500mg)中,顺次注入10mL乙腈、10mL水和5mL 2%氯化钠溶液,弃去流出液。柱中注入a 提取方法所得的溶液后,顺次注入10mL 2%氯化钠溶液和10mL水,弃去流出液。注入5mL乙腈:水(4:1)混合溶液,流出液中加入10mL乙腈:水(4:1)混合溶液,此为试验溶液。

5、操作方法

a 定量试验
    取5mL试验溶液于磨口减压浓缩器中,在40℃以下除去乙腈和水,残留物中加入1mL磷酸缓冲液(Ph6.0)溶解。将此溶液它吸入圆盘上,在55℃培养17小时,与标准品抑菌圈直径比较,进行定量。
b 确证试验
    在玻璃板上涂布0.1mm厚的薄层色谱用微晶纤维素,用作薄层板。取5mL试验溶液于磨口减压浓缩器中的,在40℃以下除去乙腈和水,残留物中加入1.0mL丙酮:水 (1:1) 混合溶液溶解。将4µl溶液点在薄层板上,用丙酮:水:1-戊醇 (1:3:4) 混合溶液作为展开溶剂,根据上升法展开100mm后,风干。在薄层板上生成薄层,放入四方型培养皿中。在1,000mL经加温溶解后保持55℃的试验用培养基中加入5mL试验菌液的混合液分别注入2mm的厚薄层板上,保持水平凝固。放置1小时后,在55℃培养17小时,与标准品的抑菌圈的Rf 值进行比較。

6.定量界

肌肉、肝脏和肾脏:0.005mg/kg,奶:0.001mg/kg

7.注意事项

(1) 标准溶液的配制
①将标准品溶解在磷酸缓冲液(pH6.0)作为标准原液(苄青霉素1,667,000单位/l,1,000mg/L)。本标准原液保存在-20℃,1年内稳定。
②用磷酸缓冲液(pH 6.0)将标准原液递减稀释,作为定量试验用标准溶液。
③ 用50%丙酮溶液将标准原液递减稀释,作为确证试验(薄层色谱法)用标准溶液。
 

 

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