1 适用范围

本方法适用于肉和肉制品中四环素族抗生素残留量的检验 

2 原理概要

四环素族 (四环素 土霉素 金霉素) 抗生素具有很强的抑菌作用。 在接有特定微生物的平板培养基上放入牛津杯， 在牛津杯内加满试样溶液 培养后测量抑菌圈的大小。 

3 主要仪器和试剂与培养基

3.1  试剂： 

3.1.1  磷酸盐缓冲液(pH4.5) 

称取磷酸二氢钾 13.6g， 溶解于蒸馏水中， 定容到 1000mL， 高压灭菌 115℃，30min 冷却后置4℃ 冰箱内保存。 

3.1.2  生理盐水称取氯化钠8.5g溶解于1 000mL蒸馏水中， 高压灭菌115℃ 30min。 

3.1.3  盐酸 0.1mol/L溶液 

3.1.4  标准四环素原液： 精确称取四环素 50mg， 用0.1mol/L 盐酸1 mL 溶解， 用水定容到 1 000mL， 在 4℃ 冰箱中可保存一周。 

3.2  培养基 

3.2.1  菌种培养基 

胰蛋白胨           10.0g

牛肉膏             5.0g

氯化钠             2.5g

琼脂               14.0- 16.0g

蒸馏水             1 000mL

将以上成分加热溶解， 高压灭菌 121℃ 15min 最终pH6.5± 0.1 

3.2.2  检定用培养基 

胰蛋白胨    6.0g

牛肉膏      1.5g

酵母膏      3.0g

琼脂        14.0 -16.0g

蒸馏水      1 000mL

将以上成分加热溶解 高压灭菌 121℃ 15min 最终pH5.8± 0.1 

3.3  仪器

3.3.1  培养皿： 内径90mm,底部平整光滑 ，具陶质盖。 

3.3.2  牛津杯： 内径6 ±0.1mm ，外径7.8 ±0.1mm 高度10± 0.1mm 

3.3.3  游标卡尺 ：测量抑菌圈直径用 

3.3.4  均质器 

3.3.5  离心机

3.3.6  恒温水浴 

3.3.7  恒温培养箱 

3.3.8  电热干烤箱170 ±0.1℃ 

4 过程简述

4.1  检样液的制备

称取试样10.0g 加入0.1mol/L磷酸缓冲液 20mL，小心搅匀放置60min 然后于均质器中均质 (3000- 6000r/min)1min， 经4 000r/min离心10min， 其上清液为检样液。 

4.2  菌液和检定用平板的制备

4.2.1  菌液的制备

菌种： 蜡样芽孢杆菌 (Bac cereus ATCC 11778) 由卫生部药品生物制品检定所提供。 

将菌种移种于盛有300mL菌种培养基的克氏瓶中， 于30℃ 培养箱中培养 7天。镜检芽孢数达到 85 %以上， 用生理盐水 25mL 洗下菌苔， 置 65℃ 恒温水浴中加热30min， 离心(2000r/min)20min 弃去上清液 ，如此重复洗涤芽孢悬液三次。 再置于65℃ 恒温水浴加热 30min ，然后取生理盐水50mL制成芽孢悬液。 置4℃ 冰箱中可保存一个月 

4.2.2  蜡样芽孢杆菌悬液用量的测定

在实际检定前先试几个平板， 即把不同浓度的芽孢悬液加入检定用培养基中，使0.05ug/mL浓度的标准四环素溶液可产生 12mm以上的清晰 、完整的抑菌圈作为最适芽孢用量。 一般用量为每 100mL检定用培养基内加芽孢悬液0.5- 1.0mL ，1.0mL菌悬液中含芽孢数约为 10⁶

4.2.3  检定用平板的制备

将适量芽孢悬液加入溶化后冷却至 55- 60℃ 的检定用培养基中混匀。 每个平皿内加入培养基6mL， 前后摇动平皿， 使含有芽孢的检定培养基均匀覆盖于平皿表面，置水平位置上盖上陶质盖， 待凝固后， 于每个平板的培养表面放置6个牛津杯， 使牛津杯在半径为2.8cm的圆面上成60度角的间距。所用平板须当天制备。 

4.3  检定

4.3.1  标准曲线的绘制

四环素稀释液 取原液用 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液稀释成0.025、 0.050、 0.100、0.200、 0.400、 0.800u g/mL 的标准溶掖 (当天用当天稀释)。 

取检定用平板18个 ，分成6组， 每组3个平板作为平行试验。 第一组于每个平板的6个牛津杯中分别加满 0.025u g/mL的标准溶液作为对照组。 第二到第六组于每个平板上的6个牛津杯中， 间隔加满0.200u g/mL的标准溶液作为参考。 各组余下的牛津杯， 根据组别顺序依次加满 0.050 、0.100 、0.200、0.400 、0.800 ug/mL的标准溶液 ，经培养后 ，以各组抑菌圈直径的校正平均值绘制标准曲线。 抑菌圈直径校正值 (mm) 等于2 -6组 (0.200ug/mL) 抑菌圈直径的平均值减去各组抑菌圈直径平均值。 用此校正值校正 0.050、 0.100 、0.200 、0.400 、0.800 ug/mL标准溶液的抑菌圈直径平均值.。 

校正后的值 ，包括 0.200ug/mL 浓度的平均值在半对数坐标纸上作图, 以抑菌圈直径为横坐标 (算术级), 以浓度为纵坐标 (对数级) 通过下列公式绘出标准曲线

L = (3a +2b+ c- e)/5

H = (3e+ 2d+ c- a)/5

式中： L—标准曲线的最低浓度的抑菌圈直径； a b e相应浓度是 0.050、 0.100、0.800u g/mL。 

H —标准曲线的最高浓度的抑菌圈直径； a d e相应浓度是 0.050、 0.400 、0.800ug/mL 

c—参考浓度(0.200u g/mL)的 45个抑菌圈直径的平均值。 

4.3.2  试样中四环素族抗生素残留量的检定

每份试样取 3个检定用平板， 在每个检定用板上， 间隔的 3个牛津杯内加满四环素标准参考浓度溶液。 另外3个牛津杯加满被检试样液， 将陶质盖重新盖好， 置30 ±1℃ 培养箱中， 培养 17± 1h 除去牛津杯翻转平板， 精确的测量产生的抑菌圈直径 (精确到 0.1mm)。 分别求出 3个检定用平板上参考浓度和被检试样抑菌圈直径数值校正后，从四环素标准曲线上查出被检试样中四环素的含量。 

5 结果计算