1. 在MS平板上铺上已灭菌的玻璃纸，接种适量的孢子悬液，涂布均匀，30度培养适当时间，刮取菌丝体,在预冷的碾钵中加入液氮碾磨2~3次。收集粉末状菌丝体小半勺于1.5 ml的指型管中。加入250 ul的悬浮缓冲液混匀置于冰上。

   2*.收集液体培养物(洗过的), 加入溶菌酶溶液（溶菌酶的终浓度为2 mg/ml，用P Buffer稀释）使终体积250 ul。 于30度水浴15 min(原生质体刚开始形成)。

   3. 加入70 ul EDTA(0.25M) , 混匀。

   4. 加入375 ul的裂解缓冲液充分混匀，溶液呈清亮状。

   5. 加入等体积的热酚, 用手震荡混匀, 于65度水浴5 min。 (a.水饱和酚应提前于65度加热, 高温下, 酚的溶解度加大。b. RNA在碱性环境中易分解。)

   6. 13,000 rpm离心5 min, 取上清。 (室温下, 酚仍有少量与水混溶, 因而上清为乳白色。)

   7. 再次加入等体积的热酚, 震荡混匀,  于65度水浴5 min. 13,000 rpm离心5 min, 取上清。

   8. 加入等体积酚/氯仿(1:1), 震荡混匀, 13,000 rpm离心5 min, 取上清。

   9. 加入等体积的氯仿, 震荡混匀, 13,000 rpm离心5 min, 取上清。 (一定要充分震荡, 以除尽残余的酚, 否则, 酚会对后续实验造成不良影响。)
   10.加入1/5体积的LiCl(10M), 两倍体积的无水乙醇, 混匀, 于-20度放置2 hr。

11.于4度, 13,000 rpm, 30 min, 有白色沉淀。

12.用80%的冰乙醇洗两次（在冰上进行），以将盐离子去除干净。

13.冷冻真空干燥。

14.溶于适当的DEPC处理过的水中，于-70度保藏。

 

注：1. 所有的枪头、指型管均需用DEPC(0.1%)（Takara）水处理。DEPC为油状，不溶于水，应充分搅拌，使其均匀分散。

    2. 所有操作必须戴上手套，而且手套要经常换。

      3. 水饱和酚： 将重蒸酚适量装于一密闭瓶中，加入酚的1/2体积的去离子水，混匀，于65℃温浴，使酚充分溶解于水。

 

   反转录：1. 反应体系（50 ul）

              模板（去除了DNA的RNA）            * ul

              引物（可以只是下游引物）（50 pmol/ul）   1 ul             

              dNTP (10 mM)                          1 ul 

              MgSO4                                2 ul

              5* buffer                               10 ul

              AMV                                  1 ul

              H2O                                   至50 ul

           2. 反应程序：

              模板、引物和水混合后60(或65)度保温4 min（保证mRNA的强二级结构完全打开），取出置于冰上再加入其他成分（避免AMV高温失活）。

              48℃           45 min

              95℃           2 min

              4 ℃           5 min

              产物于-20℃保藏。

反转录产物可不经纯化直接用于常规PCR扩增。

 

注：1. 引物设计见常规PCR扩增。但要保证引物之间不会有干扰。

2. 模板中的DNA要去除干净，做好阴性对照。（即以RNA为模板进行相同的反应。）