四、基因片段转移技术
大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化
1. 挑取保存的感受态细胞在LA平板上划单菌落。
2. 挑取长好的单菌落接入到装有5ml LB的universal瓶中，摇床过夜培养。
3. 从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6
4. 将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却
5. 离心，4℃.5000rpm.3分钟
6. 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜。
7. 离心，4℃.5000rpm.3分钟
8. 弃上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。
以上步骤均需注意无菌和低温操作。
1. 取100μl感受态细胞和5μl的酶连产物或1-2ul质粒混合
2. 冰上静置30分钟
3. 42℃热激90秒，然后在冰上放置5min
4. 加0.75ml LB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清。（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）
5. 涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。
1. 从转化子平板上挑取单菌落，在另一平板上划小方块，37℃扩大培养12小时
2. 刮取适量（偏少）的菌体悬浮于30μl快检液I溶液中振荡均匀
3. 加入15μl碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷时先使该溶液预热），立即振荡混合完全。
4. 在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃, 30min）水浴时间不宜过长。
5. 冷却至室温，直接上样跑琼脂糖凝胶电泳检测（如果菌体过多，则点样时会发现样品很粘，所以掌握不好时可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，离心的步骤。）
＊ 如果没有用苯酚处理，看胶时会发现很明显的总DNA的条带，但不影响实验结果的观察。
＊ 点样时注意点上质粒载体质粒对照，一般在快检时会出现质粒CCC构型的条带，有时也会出现OC构型的。
＊ 快检液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02％溴甲酚绿
1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;
2. 将转化子的过夜培养物转接在LB中，在合适抗生素下,37 oC培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;
3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 0.1倍体积的LB悬浮.备用;
4. 链霉菌孢子的热激和预萌发（一般的接合转移只须做热激）
(1)新鲜孢子悬浮于5ml 0.05M PH8.0 的TES;
(2)50ºC水浴热激10分钟;
(3)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;
(4)37ºC摇床分别培养2-３小时;
（5）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;
（6）在振荡器上打散孢子
或只作热激按下面步骤：将适量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培养基，50度处理10分钟，离心，去大部分上清。
5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀(不一定)
6. 30ºC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖
6. 30ºC培养数天（一般2天）可得到接合转移子.
7. 挑选接合转移子到含适当抗生素和萘啶酮酸的平板上, 验证;
（作筛选双交换菌株时继续作下面步骤）
8. 直接将得到的接合转移子作影印，寻找单抗的菌株即为双交换菌株。如果得不到，就要通过单交换菌株的松弛培养来得到双交换菌株。得到的单交换接合转移子划线
于合适的培养基(含萘啶酮酸，不含别的抗生素)松弛培养;
9. 得到的孢子或菌体稀释涂皿或划单菌落（for Bld菌株）, 影印筛选双交换.
注意事项:
1 不同的孢子热激的温度和时间不同,预培养的时间不同.
2 不同的链霉菌接合转移所用的培养基不同
预萌发培养基
Difco 酵母膏 1%
Difco 酪蛋白氨基酸 1%
CaCl2 0.1M(需配制5M的原液,分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)
链霉菌原生质体的制备
1. 在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接种100ul的孢子悬液，于30度摇床中培养36~40 hr（视具体情况，有时培养24h已足够。）。
2. 将培养物倒入universal中，用无菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000 rpm离心10 min。
3. 弃上清，将菌丝体悬浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm离心10 min，弃上清。同此法洗两次。
4. 取1 ml菌丝体，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液为50mg/ml P Buffer，终浓度为2 mg/ml，用P Buffer稀释），于30度水浴30~60 min（间隔七八分种轻轻摇动）至上清呈乳状。
5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸几次，继续温浴10 min。（使大量的原生质体释放出来。）
6. 用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的universal中，3000 rpm离心7 min（不用brake档防止其破裂）。原生质体沉淀呈黄色。
7. 弃上清 ，轻柔打散原生质体，用P Buffer洗两次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000 rpm离心7 min。（此步可省略）
8. 弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存。
注：1.. P缓冲液（原生质体转化用）（Okanishi, 1974）
蔗糖103g，K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液 2ml，蒸馏水 800ml
灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5% KH2PO4 1ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 缓冲液(pH7.2) 10ml
2．溶菌时间不能过长，否则会使原生质体破裂。离心后若看到很粘的絮状物，则说明原生质体破裂。
1. 将最多5 ul的DNA（质粒或酶连产物）加于已经装有50 ul原生质体的指型管（1.5 ml）的管壁上（不与原生质体接触）。
2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG应先灭菌，再用P Buffer配置），将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。
3. 将混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。
4. 30度培养14~20 hr后（待原生质体再生后，即平板呈雾状），用含有适当抗生素的1 ml无菌水溶液覆盖。
5. 再培养1~2 d后，可以看到小的转化子菌落长出。
1. 将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常规的CaCl2 法。（pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区，培养时温度要严格控制在30゜C以下）
2. 培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株：从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C摇床培养过夜。
3. 取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4 培养基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌体终浓度为1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖诱导λ/red 重组系统。
4. 30゜C ，200rpm摇床培养3-5h 至OD600~0.6 。
5. 将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C离心 5min。
6. 弃掉上清，加1ml预冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,摇匀。
7. 4000rpm 4゜C离心 5min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。重复上面操作：4000rpm 4゜C离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。（感受态细胞浓度越高电转效果越好）
8. 在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50ul感受态细胞与1-2ul PCR产物（经纯化，可尽量浓，但不能加得过多），混匀后立即电击，电击条件：200Ω,25uF,2.5kv, 电击结果为4.5~4.9ms 较理想。（电转化杯在70％乙醇中保存，用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下，再吹干，放冰上预冷，无水乙醇能加快吹干的速度。也可以选择0.1cm的电转化杯，但电击的参数就得变为：1.8 kV，？Ω,?uF）
9. 立即加1ml预冷的SOC，37゜C诱导培养40min（如需在同一库斯质粒上中断基因，则30゜C诱导培养）。
10. 涂LA（含100ug/ml Amp及与电转片段携带的抗性标记相应的抗生素）平板，37゜C过夜培养。（转化子中含有两种质粒，分别是重组前和重组后的质粒，所以要抽质粒再转化一次DH5a）
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