1  范围

本方法采用乳糖发酵法测定酱油中大肠菌群的 MPN值。

本方法适用于酱油中大肠菌群的测定，以 MPN/100mL报告其结果。

2  原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有

否污染肠道致病菌的可能。

3  试剂

3.1  溴甲酚紫溶液，0.4g/L 

3.2  乳糖胆盐发酵管：将蛋白胨20g、猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g及乳糖10g溶于1000 mL

水中，校正PH至 7.4，加入溴甲酚紫溶液25mL，混匀后分装每管 10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌 15min。

3.3   双料乳糖胆盐发酵管：将蛋白胨 40g、猪胆盐（或牛、羊胆盐）10g 及乳糖 20g 溶于 1000 mL水中，校正PH至 7.4，加入溴甲酚紫溶液50mL，混匀后分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。

3.4   乳糖发酵管：将蛋白胨 20g 及乳糖 10g 溶于 1000 mL 水中，校正 PH 至 7.4，加入溴甲酚紫溶液 25mL，混匀后按检验要求分装 30 mL 、10mL、3 mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。

3.5  EC肉汤：将胰蛋白胨 20g、3 号胆盐（或混合胆盐）1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾 4g、磷酸二氢钾 1.5g 及氯化钠 5g 混合，溶于 1000 mL 水中，溶解后分装有发酵倒管的试管中，并放入一个小倒管，121℃高压灭菌 15min，最终PH  为 6.9±0.2。

3.6   伊红美蓝琼脂平板： 将蛋白胨 10g、 磷酸氢二钾 2g 及琼脂 17g 溶解于蒸馏水中, 校正PH至 7.1 分装于烧瓶内， 121℃高压灭菌 15min， 临用时加入乳糖 10g 并加热溶化琼脂， 冷至 50～55℃，加入伊红美蓝溶液（6.5g/L）10 mL，摇匀，倾注平板。

3.7   革兰氏染色液：

3.7.1  结晶紫染色液：将1g 结晶紫溶解于 20 mL乙醇（950g/L）中，然后与80 mL 草酸铵溶液（10 g/L）混合均匀。

3.7.2  革兰氏碘液：将1g 碘与 2g 碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

3.7.3  沙黄复染液：将 0.25g 沙黄溶解于10 mL乙醇（950g/L）中， 然后用蒸馏水稀释至 100mL。 

4  仪器

4.1  温箱：36±1℃

4.2  恒温水浴：44.5±0.5℃

4.3  显微镜

5  操作步骤

5.1  样品处理：用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石碳酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器启开后进行检验。

5.2 检样稀释：以无菌操作，吸取酱油样品25 mL，加入装有 225mL灭菌蒸馏水的灭菌玻璃瓶内经充分振摇做成1:10 的均匀稀释液。

5.3乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量分别为 10mL 、1mL、0.1 mL稀释液，接

1种量在lmL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lmI，及lmL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3 管，置36 士l℃温箱内，培养24士2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

5.4 分离培养

    将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置 36 士 1℃温箱内，培养18一24h，

然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

5.5  革兰氏染色试验

    将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1min，水洗，然后滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗，再滴加乙醇（950g/L）脱色约30s，（或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色 10s）水洗，最后滴加沙黄复染液复染 1min。水洗，待干，镜检。

革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

5.6   证实试验

     在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1~2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，

置 36 士 1℃温箱内培养 24 士 2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

5.7  报告

     根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每 100mL大肠菌群的 MPN值。