6.5 转染QBI-293A细胞
表现 可能原因 解决方法
无空斑 a） 制备的质粒质量差 用氯化铯密度梯度法纯化用于转染的质粒
b） 时间问题 弃去培养板之前先等2~3周或更长。空斑将在2~3周内逐渐形成，如果重组子高表达蛋白，这个过程将更慢
c） 转染操作 用阳性对照来检验转染效率
d） 细胞拮抗腺病毒 从细胞库中复苏另一管细胞
e） 病毒质粒未经 PacI线性化 闭环质粒不会形成病毒空斑，转化前必须用PacI进行线性化
空斑太多 高转染效率导致空斑密度过高 由于太多数被转染细胞都将产生病毒空斑（79.5%），转染时请使用较少量的腺病毒DNA
转染后细胞高死亡率 a） 转染后钙离子未彻底去除 转染后先后用PBS/EDTA和PBS各洗一遍，去除钙离子
b）转染后细胞经胰酶消化 细胞在转染后非常脆弱，极易从壁上脱落。不要使用胰酶进行消化，这样做不仅不必要，而且还可能导致活着的细胞死亡
覆盖的琼脂糖不清澈 琼脂糖被污染 使用无菌的琼脂糖
6.6筛选和测定
表现 可能原因 解决方法无重组子 a） 挑中了背景空斑（即首先出现或最大的空斑） 挑空斑之前先等14~17天.
b） 达到或超过了载体的最大克隆能力 确认是否超过最大克隆能力；若有疑问请联系技术支持（info@qbi.com）
c） 插入基因产物有毒 在293细胞中暂时性表达蛋白以评价气度性。若有毒，请替换未可诱导或较弱的启动子
d）插入基因缺失 重组时因某些未知原因可能导致基因缺失，应筛选较多的克隆
扩增后插入基因丢失 有RCA，当大量扩增时可能发生回复突变 1）检测是否含有RCA或感染非允许细胞
2）联系技术支持，请教如何检测和限制这一现象
3）用原始病毒保存液重新空斑纯化病毒
重组时将插入基因丢失 用原始病毒保存液重新扩增
6.7 在QBI-293A细胞中表达
表现 可能原因 解决方法
重组蛋白不表达 a）基因未插入重组病毒 用病毒保存液进行PCR反应，检测是否含有目的基因
b）表达水平太低，所用方法无法检测到 优化检测蛋白表达的条件
蛋白表达水平太低 a）蛋白表达的克隆设计不够优化，如非翻译区太长、离启动子太远等等 选择最佳蛋白表达克隆。这些因素在进行克隆设计时就应考虑到
b）启动子不太适合在所用的细胞类型中表达蛋白 用另一类型细胞验证蛋白表达情况
6. 8 重组腺病毒的扩增
表现 可能原因 解决方法
病毒溶液终浓度低 病毒增值速度慢，这和很多因素有关，如插入基因的大小、毒性和重组情况等等 1） 感染时间从48小时增加到72小时，以产生完全的CPE
2） 保证三次冻融都很完全
3） 如果需要，用更大的培养器皿和更多的细胞进行更大量的扩增（代数不能太多）
6. 9 纯化
表现 可能原因 解决方法
第一次氯化铯离心后无条带形成 a） 收集的细胞量太少
b）病毒量太多 1） 感染的细胞量不够。至少需要3×108细胞，当病毒生长缓慢时则需更多细胞
2） 降低稀释度
上样量密度过大将使分离失效，适当稀释上样液
第二次氯化铯离心后无条带形成 第一步操作不当导致病毒丢失 吸取病毒带时必须非常小心，宁可吸到污染的杂质也不要漏吸，第二步将会去除污染的缺陷性颗粒第二次离心后条带分离不清晰 a) 氯化铯密度梯度制备质量差
b) 离心问题 1） 连续密度梯度必须使用密度梯度发生器小心制备，离心前切勿将梯度打乱
2） 稀释第一步中得到的病毒带
3） 不要使用直径比推荐值小的离心管，否则条带将变大
检查离心记录，速度和时间都会影响分离效果
6.10 病毒滴度测定
表现可能原因 解决方法
OD260测得的滴度与空斑测定或TCID50测定获得的滴度无相关性 a） 含有大量缺陷性颗粒
b） 稀释错误
c） 细胞密度不够 用两次氯化铯离心纯化病毒，去除缺陷性颗粒 精确测定滴度时，每个稀释度都应有复孔，稀释时必须换用枪头
进行滴度测定时细胞必须50~60%汇合
无CPE或空斑 a） 保存液滴度太低，无法检测到
b） 时间问题 1） 使用阳性对照，以确保方法和溶液的有效性
2） 降低保存液的稀释度
在推荐时间内等待空斑形成和CPE出现 保存后滴度降低 缓冲液不对或储存不当 1） 使用含2mMgcl2和5%蔗糖的10mM Tris缓冲液，PH8.0，PH值对于长期保存至关重要
2） 将病毒保存于-80℃，不主张长期保存于-20℃
3） 将病毒分装成小份，以免反复冻融后降低滴度
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